杜加亮，武 剛，梅玉婷，于傳飛，王 蘭(中國(guó)食品藥品檢定研究院?jiǎn)慰寺】贵w產(chǎn)品室，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629；共同第一作者；通訊作者，E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

采用高蛋白濃度(≥100 mg/ml)配制的治療性抗體藥物約占美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的全部治療性抗體藥物的三分之一(34/103)，而且2015年以后批準(zhǔn)的數(shù)量占76%(26/34)，最高濃度為200 mg/ml，主要為皮下給藥途徑[1]。抗體藥物的高濃度制劑將是治療性抗體制劑發(fā)展的未來(lái)趨勢(shì)[2]。但是，高濃度抗體藥物的開(kāi)發(fā)也面臨著許多挑戰(zhàn)，其中輔料配方可以影響藥物的穩(wěn)定性(聚體、氧化等)[3]。研究表明，使用包含聚山梨醇酯、組氨酸和蔗糖的平臺(tái)制劑以加速抗體藥物的高濃度制劑開(kāi)發(fā)可能是合理的[1]。在FDA批準(zhǔn)的34種治療性抗體高濃度制劑的輔料中，聚山梨酯(94%)、組氨酸(82%)、蔗糖(48%)是使用頻率排名前三的輔料[1，4]。因此，在高濃度抗體藥物放行時(shí)，要對(duì)輔料進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制。

聚山梨酯是最常用的表面活性劑，而組氨酸有助于聚山梨酯顆粒的穩(wěn)定性以及維持治療性蛋白制品的pH值[5-7]。組氨酸因不含生色基團(tuán)，無(wú)法采用常規(guī)的紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)，所以需要通過(guò)衍生劑將氨基酸轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物[8]才能被檢測(cè)到。本研究擬采用柱前衍生反相高效液相色譜法(reverse-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)建立組氨酸含量測(cè)定方法并進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

單抗藥物樣品mAb-1(蛋白濃度為4.5 mg/ml)為含有已知濃度L-組氨酸(理論濃度為3.10 mg/ml)、蔗糖和吐溫-20為輔料的單抗樣品，由本實(shí)驗(yàn)室保存。L-組氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，符合英國(guó)藥典、歐洲藥典、美國(guó)藥典/國(guó)家處方集和日本藥典標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)為H6034。蔗糖購(gòu)自德國(guó)Millipore公司(貨號(hào)：100892)，吐溫-20購(gòu)自德國(guó)Fluka公司(貨號(hào)：44112)。色譜級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：34851)。AccQTag洗脫劑A(貨號(hào)：WAT052890)和AccQ Fluor試劑盒(貨號(hào)：WAT052880)購(gòu)自美國(guó)waters公司。

1.2 高效液相色譜系統(tǒng)及參數(shù)

使用配有紫外檢測(cè)器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的Waters HPLC系統(tǒng)Alliance e2695和氨基酸色譜柱(AccQ Tag，粒徑4 μm，3.9 mm×150 mm)。色譜條件如下：流動(dòng)相A為用水1 ∶10(V/V)稀釋的AccQTag洗脫劑A，流動(dòng)相B為含60%乙腈的水溶液。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣體積為5 μl，柱溫為25 ℃，樣品室溫度5 ℃，流速為1.0 ml/min，洗脫時(shí)間為35 min，洗脫方式為梯度洗脫(0～26 min，4%→7%流動(dòng)相B；26～26.01 min，7%→100%流動(dòng)相B；26.01～30 min，100%→4%流動(dòng)相B；30～35 min，4%流動(dòng)相B)。

1.3 樣品制備

用超純水配制兩份單獨(dú)的濃度為0.03 mg/ml的組氨酸溶液，作為組氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1和2(His_STD-1和His_STD-2)，其中His_STD_1用于樣品中組氨酸濃度計(jì)算和系統(tǒng)適應(yīng)性計(jì)算，His_STD_2用做質(zhì)控樣品。空白樣品為超純水。專屬性樣品為配方緩沖液1(含5%蔗糖、0.01%吐溫20、20 mmol/L組氨酸，pH 6.0)和不含組氨酸的配方緩沖液(含5%蔗糖、0.01%吐溫20，pH 6.0)。使用不含組氨酸的配方緩沖液(也用作加標(biāo)緩沖液1)和含組氨酸的配方緩沖液2(含15.5 mg/ml組氨酸、5%蔗糖、0.01%吐溫20，pH 6.0)分別按照9 ∶1，8 ∶2，7 ∶3和6 ∶4的體積比例配制組氨酸理論濃度分別為1.55，3.10，4.65，6.21 mg/ml的加標(biāo)緩沖液2～5，然后分別混合1 400 μl mAb-1抗體溶液和600 μl加標(biāo)緩沖液1～5，配制成組氨酸理論濃度分別為2.170，2.635，3.100，3.565，4.033 mg/ml的70%，85%，100%，115%和130%的加標(biāo)溶液1～5(見(jiàn)表1)，用于準(zhǔn)確性、線性和檢測(cè)范圍的驗(yàn)證。

表1 加標(biāo)溶液的制備Table 1 Preparation of the spiking solutions

1.4 樣品進(jìn)樣與數(shù)據(jù)分析

首先用超純水平衡系統(tǒng)，然后再依次按以下順序進(jìn)樣：組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1(6次)、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品2(2次)、樣品(2次)、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1(1次)。組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的括號(hào)進(jìn)樣(序列前6次和序列后1次)用于評(píng)價(jià)系統(tǒng)適應(yīng)性，且進(jìn)樣次數(shù)足夠用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣品重復(fù)進(jìn)樣2次取平均值用于計(jì)算樣品中組氨酸濃度。選取色譜圖中的組氨酸做積分運(yùn)算，使用組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1的濃度與峰面積繪制經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線方程：組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1平均峰面積=b(斜率)×組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1濃度，則樣品中組氨酸的濃度(mg/ml)=樣品峰面積×100÷b=樣品峰面積×組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1濃度×100÷組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1平均峰面積(其中100為樣品的稀釋倍數(shù))。

1.5 驗(yàn)證方案

1.5.1 專屬性 使用mAb-1和不含組氨酸的配方緩沖液進(jìn)行專屬性驗(yàn)證，分別進(jìn)樣3次，可接受標(biāo)準(zhǔn)為在組氨酸的保留時(shí)間范圍內(nèi)必須無(wú)配方緩沖液組分和分析溶劑的干擾，且mAb-1和組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液中組氨酸保留時(shí)間的偏差必須≤5%。

1.5.2 準(zhǔn)確度 使用加標(biāo)溶液70%，100%和130%進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證，可接受標(biāo)準(zhǔn)為各水平的平均回收率為90%～110%，且各水平下3次獨(dú)立測(cè)定的濃度變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.3 重復(fù)性 使用mAb-1進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，可接受標(biāo)準(zhǔn)為6次獨(dú)立測(cè)定的濃度變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.4 中間精密度 由兩位實(shí)驗(yàn)人員分別在3個(gè)工作日對(duì)mAb-1進(jìn)行3次獨(dú)立的組氨酸含量測(cè)定用于評(píng)估中間精密度，可接受標(biāo)準(zhǔn)為18次獨(dú)立測(cè)定的濃度變異系數(shù)必須≤10%。

1.5.5 線性關(guān)系 使用加標(biāo)溶液1～5進(jìn)行線性驗(yàn)證。以組氨酸含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制回歸方程?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)為決定系數(shù)R2≥0.98，y軸截距的置信區(qū)間必須包含原點(diǎn)，各濃度水平的回收率應(yīng)在90%～110%范圍內(nèi)，變異系數(shù)應(yīng)≤5%。

1.5.6 檢測(cè)范圍 用檢測(cè)范圍下限(70%加標(biāo))和上限(130%加標(biāo))的6次測(cè)定驗(yàn)證檢測(cè)范圍，可接受標(biāo)準(zhǔn)為各水平的平均回收率必須在90%～110%范圍內(nèi)，各水平的變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.7 耐用性 樣品和對(duì)照品于自動(dòng)進(jìn)樣器中貯存0 h和24 h后，在同一個(gè)系統(tǒng)上分析樣品，評(píng)價(jià)各自的穩(wěn)定性，可接受標(biāo)準(zhǔn)為樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品溶液的各時(shí)間點(diǎn)的平均回收率與0 h相比必須在90%～110%范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的專屬性驗(yàn)證

結(jié)果表明所有配方緩沖液組分均不干擾組氨酸峰(見(jiàn)圖1)，mAb-1樣品和組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1中組氨酸的保留時(shí)間(分別為17.789，17.870 min)偏差為0.45%(見(jiàn)圖2)，符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 基質(zhì)緩沖液和不含組氨酸的基質(zhì)緩沖液的重疊色譜圖Figure 1 Overlaid chromatograms of matrix buffer and matrix buffer without histidine

圖2 組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、mAb-1和對(duì)照品的重疊色譜圖Figure 2 Overlaid chromatograms of histidine standard， mAb-1 and blank samples

2.2 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的準(zhǔn)確度驗(yàn)證

結(jié)果表明3個(gè)加標(biāo)溶液70%，100%，130%的平均回收率在96.1%～101.9%范圍內(nèi)，變異系數(shù)在0.5%～1.1%范圍內(nèi)(見(jiàn)表2)，符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法的準(zhǔn)確度符合要求。

表2 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results on the accuracy of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.3 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的重復(fù)性(精密度)驗(yàn)證

重復(fù)性驗(yàn)證使用的mAb-1(蛋白濃度為4.5 mg/ml)為含有已知濃度L-組氨酸(理論濃度為3.100 mg/ml)的單抗溶液。6次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果顯示，組氨酸的實(shí)測(cè)濃度均值為(3.151±0.038)mg/ml，變異系數(shù)為1.2%，95%置信區(qū)間為3.110～3.191 mg/ml(見(jiàn)表3)，符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法具有很好的重復(fù)性。

表3 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results on the repeatability of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.4 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的中間精密度驗(yàn)證

中間精密度驗(yàn)證使用的樣品同重復(fù)性驗(yàn)證。兩位實(shí)驗(yàn)人員分別在3個(gè)工作日進(jìn)行的18次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果顯示，組氨酸平均濃度為(3.273±0.101)mg/ml，變異系數(shù)為3.1%，95%置信區(qū)間為3.167～3.379 mg/ml(見(jiàn)表4)，符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法通過(guò)了中間精密度驗(yàn)證的要求。

表4 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results on the intermediate precision of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.5 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的線性驗(yàn)證

線性驗(yàn)證使用的是5個(gè)不同水平的加標(biāo)溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)試，以組氨酸計(jì)算濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖和趨勢(shì)線。結(jié)果顯示，組氨酸濃度和峰面積形成y=109 274x-6 925.8的線性關(guān)系，其決定系數(shù)R2=0.995 0(見(jiàn)圖3)。y軸截距的95%置信區(qū)間(-3 328.6～9 262.3)包含原點(diǎn)。各水平下的回收率和變異系數(shù)均在驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(見(jiàn)表5)，表明在分析范圍內(nèi)(2.170～4.033 mg/ml，即10.85～20.15 μg)組氨酸濃度與檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)呈線性關(guān)系。

表5 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results on the linearity of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

圖3 組氨酸濃度與檢測(cè)信號(hào)的線性關(guān)系Figure 3 Linear correlation of histidine concentration and detection signals

2.6 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的檢測(cè)范圍驗(yàn)證

本部分再次對(duì)組成線性的上限和下限2個(gè)濃度點(diǎn)分別進(jìn)行了6次獨(dú)立的測(cè)試。結(jié)果證明，檢測(cè)范圍的下限(平均回收率：94.2%/CV=1.1%)和上限(平均回收率：95.1%/CV=1.1%)均具有良好的精密性和準(zhǔn)確度(見(jiàn)表6)，符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

表6 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的檢測(cè)范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results on the detection range of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.7 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的耐用性驗(yàn)證

該方法中，對(duì)結(jié)果影響較大的因素為衍生后樣品的穩(wěn)定性，因此耐用性主要考察該影響因素。結(jié)果表明，相對(duì)于0 h，衍生后mAb-1樣品在(5±3)℃密封瓶條件下在自動(dòng)進(jìn)樣器中暫存24 h后的回收率為100.3%，而衍生對(duì)照品在(5±3)℃密封瓶條件下在自動(dòng)進(jìn)樣器中暫存26 h后的回收率為100.2%(見(jiàn)表7)，均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

表7 RP-HPLC法測(cè)定單抗藥物中組氨酸含量的耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results on the robustness of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

3 討論

由于多數(shù)氨基酸沒(méi)有顯色基團(tuán)，無(wú)法用簡(jiǎn)單的方法檢測(cè)，而且所有的氨基酸極性都很大，無(wú)法反相分離。因此需要進(jìn)行衍生處理，增加顯色基團(tuán)(紫外或熒光)，提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)改變樣品的極性，變離子型化合物為非離子型，改變分離模式，用反相方法分離[9]。本研究利用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate，AQC)衍生試劑建立的柱前衍生RP-HPLC紫外檢測(cè)單抗藥物中組氨酸含量的方法在2.17～4.03 mg/ml(即10.85～20.15 μg)范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。同時(shí)，本研究嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2020年版三部中分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[10]和ICH協(xié)調(diào)三方指導(dǎo)原則(ICH Harmonised Tripartite Guideline)Q2[11]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

理論上，方法驗(yàn)證中應(yīng)使用除了不含待測(cè)物質(zhì)外，其他成分與待測(cè)樣本完全一致的溶液來(lái)評(píng)價(jià)其專屬性[7，12，13]。但是，在單抗的生產(chǎn)工藝中，為了保證原液的穩(wěn)定性，在原液制備時(shí)就加入了配方緩沖液。在此之前的中間產(chǎn)物雖然不含配方緩沖液，但是不易獲取和保存。首先通過(guò)使用不含組氨酸的配方緩沖液和完整配方緩沖液的比較，排除其他輔料對(duì)組氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)使用含完整配方的抗體溶液和組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的比較，檢查抗體蛋白對(duì)組氨酸的保留時(shí)間是否有影響。

準(zhǔn)確度驗(yàn)證使用了高(4.033 mg/ml)、中(3.100 mg/ml)、低(2.170 mg/ml)3個(gè)濃度的組氨酸加標(biāo)溶液。如上所述，由于無(wú)法獲得不含組氨酸的抗體溶液，本研究中使用的加標(biāo)溶液(也包括文中線性和工作范圍驗(yàn)證中使用到的加標(biāo)溶液)是使用含完整配方的抗體溶液和含不同濃度組氨酸的配方緩沖液按一定比例配制而成，以其理論濃度作為真實(shí)值，比較檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值的偏差。

在線性驗(yàn)證中，組氨酸濃度和峰面積可以形成一條經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線方程。因此，在方法的實(shí)際應(yīng)用時(shí)，為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作和計(jì)算過(guò)程，使用單個(gè)點(diǎn)的組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積繪制經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線方程，得到峰面積相對(duì)于濃度的斜率，再通過(guò)樣品的峰面積和斜率計(jì)算樣品中組氨酸的濃度。

綜上所述，該方法具有良好的專屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、線性和耐用性，可作為單克隆抗體制品的組氨酸質(zhì)量控制方法。