范巨峰,芮宏亮,宋 森,張巖崑,范微微,呂 偉,周 璐,李 晶,黃文罡,侯 瑩

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實驗研究

人尿道黏膜上皮細胞系與脫細胞羊膜基質復合培養(yǎng)的實驗研究

范巨峰,芮宏亮,宋 森,張巖崑,范微微,呂 偉,周 璐,李 晶,黃文罡,侯 瑩

目的 探討人尿道黏膜上皮細胞系與脫細胞羊膜基質復合培養(yǎng)的效果。方法 將人尿道黏膜上皮細胞系接種于脫細胞羊膜基質上，待細胞在脫細胞羊膜基質上生長至鋪滿表面，用活細胞示蹤劑標記細胞，然后將脫細胞羊膜基質固定、封片，倒置相差和熒光顯微鏡下進行觀察。結果 人尿道黏膜上皮細胞系細胞在脫細胞羊膜基質上生長，細胞呈單層生長，活細胞示蹤劑顯示細胞生長良好，并具有活細胞功能。結論 人尿道黏膜上皮細胞系是良好的實驗室組織工程化尿道種子細胞，脫細胞羊膜基質是良好的實驗室組織工程化尿道支架材料，適用于實驗室組織工程化尿道復合過程研究。

組織工程; 人尿道黏膜上皮細胞系; 脫細胞羊膜基質; 復合培養(yǎng)

先天性尿道下裂、反復手術失敗型尿道下裂與先天性尿道上裂、陰莖缺損等畸形都存在尿道缺損，需要再造尿道，這是整形外科和泌尿外科共同的治療難題[1-2]。組織工程化尿道的構建即應用組織工程學的原理與方法，構建具有正常形態(tài)功能的尿道組織，從而達到修復缺損與畸形的目的。其相關研究主要包括4個方面：種子細胞的研究、支架材料的研究、細胞與支架的復合過程研究、組織工程化尿道的構建。自2013年3月起，我們的實驗主要探討人尿道黏膜上皮細胞系(normal human urinary tract epithelial cells, SV-HUC-1)與脫細胞羊膜基質(human acellular amniotic membrane matrix, HAAM)的復合過程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 F-12K培養(yǎng)基(美國INVITROGEN公司)；胎牛血清(FBS，美國HYCLONE公司)；青霉素(華北制藥廠)；鏈霉素(華北制藥廠)；胰蛋白酶(美國SIGMA公司)；NaCl分析純、KCl分析純、Na2HPO4分析純、KH2PO4分析純、NaHCO3分析純、苯酚紅(北京化學試劑公司)；直徑90 mm塑料細胞培養(yǎng)皿(美國CORNING公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本NAPCO公司，型號：5410)；超凈操作工作臺(北京半導體設備一廠)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠，型號：LD4-2)；高溫烤箱(日本SAKURA公司，型號：HE-21)；微量加樣槍(德國EPPENDORF公司)、超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所，型號：JY-96-2)。

1.2 主要溶液配制 ⑴含10%FBS的F-12K培養(yǎng)液：在500 ml的F-12K培養(yǎng)基中，加入青鏈霉素混合液10 ml(青霉素和鏈霉素終濃度分別為100 U/ml和0.1 mg/ml)和FBS 55 ml，分裝后4℃保存。⑵D-Hanks平衡鹽溶液：量取800 ml超純水，依次加入NaCl 8.00 g、KCl 0.40 g、Na2HPO40.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.35 g和苯酚紅0.02 g(電磁攪拌器攪拌，待1種試劑完全溶解后，再加入另一種試劑)，完全溶解后，補足雙蒸水至1000 ml，測定pH 7.2～7.4，分裝，高壓(100～150 kPa)滅菌20 min，室溫冷卻，-20℃保存。⑶胰蛋白酶(0.05%)EDTA(0.02%)溶液：量取D-Hanks平衡鹽溶液300 ml，加入胰蛋白酶 0.25 g，電磁攪拌器攪拌，直至完全溶解；另外量取D-Hanks平衡鹽溶液200 ml，加入EDTA 0.10 g，電磁攪拌器攪拌，直至完全溶解，混合2種溶液，以NaHCO3調節(jié)pH 7.4，用不銹鋼正壓膜過濾系統(tǒng)除菌后，分裝，-20℃保存，4℃?zhèn)溆?。⑷細胞凍存液：分別量取F-12K培養(yǎng)液7 ml、DMSO 1ml和FBS 2 ml，混合均勻，配制成含20%FBS、10%DMSO的凍存液，-20℃保存，室溫備用。

1.3 實驗方法 ⑴種子細胞制備：將生長至70%融合的SV-HUC-1細胞以PBS清洗2遍，0.25%胰酶-EDTA消化3 min后加入終止液，然后吸入離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，留取細胞備用。⑵支架材料制備：羊膜脫細胞過程，通過鈍性分離胎盤羊膜后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，培養(yǎng)皿中甘油浸泡3次，用生理鹽水反復沖洗羊膜，用胰酶消化羊膜表層的細胞，振蕩、沖洗制成HAAM置于磷酸鹽緩沖液中，制成脫細胞羊膜。將HAAM在含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基中浸泡1 h，然后鋪于培養(yǎng)皿底部。⑶種子細胞與支架材料的復合：將第10代傳代SV-HUC-1細胞按1×106/cm2，接種于HAAM上，置于培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，待細胞在HAAM上生長至鋪滿表面，用活細胞示蹤劑標記細胞，然后將HAAM固定、封片，于倒置相差和熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結果

SV-HUC-1細胞在HAAM上生長，細胞呈單層生長，活細胞示蹤劑顯示細胞生長良好。倒置相差顯微鏡觀察顯示，HAAM上和非羊膜部分的細胞生長良好，形態(tài)規(guī)整；倒置熒光顯微鏡顯示，生長在HAAM上的SV-HUC-1細胞存活良好(圖1)。

3 討論

尿道下裂是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)先天性畸形，手術矯治是目前治療尿道下裂的唯一有效方法，但治療難度大，手術并發(fā)癥相對較高。目前尿道下裂的手術方法主要包括：尿道口前移陰莖頭成形術；以Danis-Browne法為代表的陰莖皮條埋藏法；以帶蒂陰莖、陰囊皮瓣修復尿道的手術方法；以膀胱黏膜、口腔頰黏膜等游離代替物修復尿道的手術方法等。而無論應用哪種手術方式，術后并發(fā)癥均嚴重影響了尿道下裂的治療效果。組織工程學的興起為組織或器官的重建開辟了新的途徑。其方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關活細胞種植于天然的或人工合成的細胞外基質上，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，將他們移植到體內，以達到重建新的有功能性組織的目的[3-4]，其核心內容是建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體[5-6]。與傳統(tǒng)的修復尿道方法相比，組織工程化尿道具有諸多優(yōu)點：其組織結構為正常尿道黏膜，無論用于再造尿道或修復尿道缺損，其內環(huán)境更接近于正常尿道環(huán)境，更符合正常人體生理要求；在治療過程中不增加新的創(chuàng)傷，減少患者的痛苦；可以大大降低尿道狹窄、毛發(fā)生長、結石形成等手術并發(fā)癥的發(fā)生率[5-6]。隨著氣管、血管等組織工程化人體空腔器官的研究進展，對組織工程化尿道的相關研究逐漸得到重視并成為未來的發(fā)展趨勢。

圖1 SV-HUC-1細胞在HAAM上生長 a,b. HAAM上和非羊膜部分的細胞生長良好，形態(tài)規(guī)整(倒置相差顯微鏡 ×10) c,d. HAAM上SV-HUC-1細胞存活良好(倒置熒光顯微鏡 ×20)
Fig 1 SV-HUC-1 on human acellular amniotic membrane matrix (HAAM). a,b. cells grew well on SIS and iSIS, cell morphology was regular form (inverted phase contrast microscope ×10). c,d. SV-HUC-1 grew well on HAAM (inverted fluorescence microscope ×20).

在應用組織工程學原理構建尿道過程中，選擇合適的種子細胞是確保研究實施的重要條件。直接取自人體或動物的成體膀胱黏膜上皮細胞和尿道黏膜上皮細胞是常用的構建組織工程化尿道的種子細胞。來自泌尿系統(tǒng)的上皮細胞是最適宜用于尿道組織工程的種子細胞，但取自人體或動物的成體泌尿系上皮細胞在經(jīng)歷若干代傳代后性質發(fā)生較大變化，雖然有研究報道在較短的時間內獲得大量擴增的尿道黏膜上皮細胞用于組織工程化尿道的構建[7]，但多數(shù)研究在應用人體或動物成體細胞作為種子細胞時，在體外培養(yǎng)其傳代多為10代以內，之后細胞發(fā)生不同程度的變性[8-10]，成為組織工程化尿道進一步研究的“瓶頸”。本研究旨在探討組織工程種子細胞與支架材料的復合過程，需要1種可以反復傳代而不發(fā)生變性的尿道黏膜上皮種子細胞，繞過成體細胞難以大量傳代這一難以避免的事實對整個實驗過程的干擾，使實驗順利的進行。因此，本實驗選用SV-HUC-1作為種子細胞，這種細胞來源于泌尿系上皮細胞，其特點是在多次傳代后仍能夠保持原有的細胞性質。在前期實驗中我們已經(jīng)證實，SV-HUC-1細胞在經(jīng)過體外培養(yǎng)20代后，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，細胞形態(tài)正常；經(jīng)細胞鑒定提示，泌尿系細胞標志蛋白Vimentin和CK-18的mRNA表達正常；經(jīng)活細胞示蹤劑示綜顯示，細胞活性良好。證實SV-HUC-1經(jīng)體外培養(yǎng)多次傳代后仍保持原有細胞特性，是適合用于尿道組織工程實驗研究的理想種子細胞[11]。本實驗應用經(jīng)過體外培養(yǎng)10代后的SV-HUC-1作為種子細胞。

生物支架材料在組織工程研究中同樣起重要作用，組織工程中所用的支架材料包括合成材料和天然生物材料。合成材料的優(yōu)點是能大量生產(chǎn)并可根據(jù)需要設計材料的特性，但缺點是組織相容性差，可引起不同程度的炎癥反應，而且這些材料上培養(yǎng)的細胞和構建的組織，在結構和功能上都與體內情況不完全相同。而天然細胞外基質因其演變過程與臨床實際情況近似，在體內的網(wǎng)架結構、空間結構良好，且細胞親和性好，所以更適用于組織工程[12-13]。目前較為常用的方法是采用單純脫細胞的膠原筋膜，經(jīng)修剪后，植入缺損尿道進行修復。如果尿道缺損過長，面積過大，單純采用脫細胞膠原筋膜修復，效果不甚理想[14]。膀胱黏膜下層和小腸黏膜下層常被用作尿路組織的修復材料，但單獨作為移植物時，容易發(fā)生攣縮現(xiàn)象。理想的生物支架應具有如下條件：良好的組織相容性；可降解性和降解速率的可控性；無抗原作用；三維立體結構，能夠提供細胞黏附和生長空間；易塑形并有一定的機械強度，能夠調節(jié)細胞黏附、增殖、轉移和分化。脫細胞羊基質是通過生物化學方法，去除組織中的細胞和抗原成分，保留細胞外基質框架，其特殊的組織結構利于細胞黏附和生長。因其特有的結構特點和促進組織修復的生物學基礎，具備上述理想生物支架材料的各種特點，已成為國內外組織工程研究常用的支架材料選擇。新鮮人羊膜具有5層結構：上皮細胞層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層。羊膜具有以下特點：含有纖維粘連素、層粘連素、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、其他蛋白多糖大分子和多種細胞生長因子，如表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子,有促進細胞黏附、遷移、增殖、分化等重要功能，羊膜基底膜易于誘導上皮細胞移行長入,增強上皮細胞的黏附性,促進上皮的分化、增殖,阻止上皮細胞凋亡，并含有多種蛋白酶抑制劑,通過抑制相應的蛋白酶而發(fā)揮抗炎作用[15]。因脫掉細胞成分后羊膜基質無免疫原性，所含的Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及硫酸肝素蛋白多糖等成分有利于種子細胞黏附、移行及上皮化，防止細胞凋亡，而且羊膜來源廣泛，取材方便，易于處理和保存[15]，是一種理想的生物支架。

本實驗發(fā)現(xiàn)，SV-HUC-1在HAAM上可以生長良好，與支架材料復合良好。證實SV-HUC-1是良好的實驗室組織工程化尿道種子細胞，HAAM是良好的組織工程化尿道支架材料，適用于實驗室組織工程化尿道復合過程研究。本研究通過觀察人尿道黏膜上皮細胞系與HAAM復合培養(yǎng)的效果，為今后組織工程化尿道的復合階段研究提供了可靠的前期研究基礎。

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Research of composite culture of human urinary tract epithelial cells with human coacellular amniotic membrane matrix

FANJu-feng,RUIHong-liang,SONGSen,ZHANGYan-kun,FANWei-wei,LYUWei,ZHOULu,LIJing,HUANGWen-gang,HOUYing.

(DepartmentofPlasticSurgery,BeijingChaoyangHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Objective To discuss the effect of composite culture of normal human urinary tract epithelial cells (SV-HUC-1) with human acellular amniotic membrane matrix (HAAM). Methods SV-HUC-1 was inoculated on human acellular amniotic membrane matrix and the cells were tracked with viable cell tracer when growing on the surface of the amniotic membrane matrix. Then, the cells were observed with inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope. Results SV-HUC-1 grew well on HAAM with normal monolayer morphology, which was proven by viable cell tracer. Conclusion SV-HUC-1 is a desirable seed cell for urinary tract tissue engineering and grows well on HAAM.

Tissue engineering; Normal human urinary tract epithelial cells; Human acellular amniotic membrane matrix; Composite culture

北京市科技新星(2005B04)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次人才(2011-3-019)；北京市衛(wèi)生局“十百千”人才計劃

100020 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 整形外科(范巨峰, 張巖崑, 范微微, 呂 偉, 周 璐, 李 晶, 黃文罡, 侯 瑩);衛(wèi)生部中日友好臨床研究所 中心實驗室(芮宏亮);清華大學醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(宋 森)

范巨峰(1971-)，男，遼寧大連人，主任醫(yī)師，博士后.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.018

R318.08

A

1673-7040(2016)04-0246-04

2015-11-14)