曲友直 楊震 李敏 高國(guó)棟

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黃芪甲苷對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用及IL-1β含量、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

曲友直 楊震 李敏 高國(guó)棟

目的 探討黃芪甲苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將SD大鼠72只隨機(jī)等分為4組：假手術(shù)組、生理鹽水對(duì)照組、小劑量黃芪甲苷治療組(10 mg/kg)和大劑量黃芪甲苷治療組(20 mg/kg)，采用分光光度計(jì)法、酶聯(lián)免疫吸附法及免疫組化法分別檢測(cè)各組大鼠腦組織伊文氏藍(lán)、IL-1β含量及MMP-9蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，生理鹽水對(duì)照組腦組織伊文氏藍(lán)含量明顯增多、IL-1β含量顯著增高、MMP-9蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與生理鹽水對(duì)照組相比，小劑量黃芪甲苷治療組及大劑量黃芪甲苷治療組腦組織伊文氏藍(lán)含量均顯著減少、IL-1β含量明顯降低、MMP-9蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)；小劑量黃芪甲苷治療組與大劑量黃芪甲苷治療組相比，伊文氏藍(lán)、IL-1β含量及MMP-9蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 黃芪甲苷對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障具有保護(hù)作用，這可能與其下調(diào)IL-1β含量、抑制MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)。

黃芪甲苷 腦缺血再灌注 血腦屏障 IL-1β MMP-9

血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎(chǔ)[1-2]?；ぴ诰S持BBB穩(wěn)定性中起重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)可通過(guò)降解毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)破壞BBB基膜，與腦缺血再灌注后BBB的破壞密切相關(guān)[3]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，常作為黃芪及含黃芪(君藥)的中成藥定性定量評(píng)價(jià)的指標(biāo)[4-5]。已有研究表明黃芪甲苷具有減少腦缺血再灌注后腦組織白細(xì)胞浸潤(rùn)、抗炎性反應(yīng)、減輕腦水腫等作用，但目前作用機(jī)制尚不明確[4-6]。本研究通過(guò)觀察黃芪甲苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織伊文氏藍(lán)(Evans Blue，EB)含量、IL-1β含量及MMP-9蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討其對(duì)BBB的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪甲苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)為110781-200613)。伊文氏藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。IL-1β定量ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)BIOSOUCE公司。MMP-9蛋白免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymed公司。醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，型號(hào)Olympus BX-51。健康成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立

將72只SD大鼠隨機(jī)等分為4組，每組各18只,假手術(shù)組:栓線僅插入頸總動(dòng)脈6 mm，不阻塞大腦中動(dòng)脈，其余步驟同生理鹽水對(duì)照組；生理鹽水對(duì)照組:參照Z(yǔ)ea Longa[7]報(bào)道的方法，采用線栓法制備局灶性腦缺血1.5 h再灌注24 h模型,再灌注即刻經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水;小劑量黃芪甲苷治療組:再灌注即刻經(jīng)腹腔注射黃芪甲苷10 mg/kg；大劑量黃芪甲苷治療組:再灌注即刻經(jīng)腹腔注射黃芪甲苷20 mg/kg。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 每組中隨機(jī)取6只大鼠于處死前1 h經(jīng)股靜脈緩慢注入2.5%伊文氏藍(lán)生理鹽水液0.2 mL/100 g,斷頭取腦稱(chēng)重后放入甲酰胺中浸泡，收集浸泡的甲酰胺溶液，用分光光度計(jì)測(cè)得其吸光度，計(jì)算腦組織中EB含量。

1.3.2 每組中再隨機(jī)取6只大鼠斷頭取腦，于冰盤(pán)上迅速剝離缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，按腦濕重∶生理鹽水=100 mg∶1 mL的比例加入生理鹽水勻漿,離心后取上清液，采用ELISA法測(cè)定IL-1β含量。

1.3.3 每組其余6只大鼠,在術(shù)后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)4%多聚甲醛溶液固定,斷頭取腦，鼠腦自額極至枕葉分為A、B、C、D、E 5等份,取C腦片在恒溫冰凍切片機(jī)上做厚度為15 μm的冠狀面切片,進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化染色用圖像分析系統(tǒng)采集照片,在400倍視野下每張切片在梗死灶周?chē)S機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組相比，生理鹽水對(duì)照組大鼠腦組織伊文氏藍(lán)含量明顯增多、IL-1β含量顯著增高、MMP-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與生理鹽水對(duì)照組相比，小劑量黃芪甲苷治療組和大劑量黃芪甲苷治療組伊文氏藍(lán)含量均顯著減少、IL-1β含量明顯降低、MMP-9蛋白表達(dá)顯著減弱(P<0.05)；小劑量黃芪甲苷治療組與大劑量黃芪甲苷治療組比較，伊文氏藍(lán)、IL-1β含量及MMP-9蛋白免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠腦組織伊文氏藍(lán)、IL-1β含量及MMP-9 蛋白表達(dá)的變化,n=6)

注:與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與生理鹽水對(duì)照組比較，*P<0.05； 與小劑量黃芪甲苷治療組比較，▲P>0.05

3 討 論

腦水腫是腦缺血再灌注損傷的基本病理變化之一，也是導(dǎo)致病情加重、甚至引起患者死亡的常見(jiàn)病因。血腦屏障的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎(chǔ)[1-2]。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮基膜在維持BBB穩(wěn)定性中起重要作用[3]。MMP-9是一種糖蛋白，可由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，屬于Zn2+依賴(lài)性蛋白酶，主要功能是降解和重疊內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)。分泌MMP-9的細(xì)胞也同時(shí)分泌組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)，腦缺血再灌注后MMP-9高表達(dá)，使其與TIMP-1之間的平衡失調(diào)是引起基質(zhì)破壞的重要因素[8]。近年研究已表明，IL-1β是一種具有多效性作用的促炎性細(xì)胞因子，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL-1β在腦缺血再灌注損傷中具有增加缺血組織興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，增加腦缺血神經(jīng)細(xì)胞鈣超載，刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附因子，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡基因的表達(dá)等重要作用。

IL-1β可通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附激發(fā)炎癥反應(yīng)，從而上調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)，破壞腦毛細(xì)血管內(nèi)皮基膜，血腦屏障損害導(dǎo)致血管源性腦水腫和出血，加重繼發(fā)性腦損傷。同時(shí)，MMP-9通過(guò)對(duì)富含基底膜的毛細(xì)血管床過(guò)度降解而使BBB開(kāi)放，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞和因子侵入，發(fā)揮正反饋?zhàn)饔茫虼薓MP-9是炎癥反應(yīng)重要的“調(diào)節(jié)劑”[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小劑量黃芪甲苷均可降低腦缺血再灌注后腦組織伊文氏藍(lán)含量。正常情況下伊文氏藍(lán)進(jìn)入體內(nèi)后與血清白蛋白結(jié)合不能通過(guò)BBB。大鼠腦缺血再灌注后腦伊文氏藍(lán)含量顯著增加,表明血腦屏障在缺血再灌注損傷中結(jié)構(gòu)遭到破壞,通透性顯著提高；使用黃芪甲苷治療后伊文氏藍(lán)含量明顯降低,提示黃芪甲苷能夠減輕缺血、缺氧造成的BBB通透性改變,一定程度上降低了腦細(xì)胞的水腫程度,遏制腦缺血病程的發(fā)展,從而發(fā)揮對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小劑量黃芪甲苷均可顯著下調(diào)缺血再灌注后腦組織MMP-9蛋白的高表達(dá)，從而改善腦缺血再灌注后MMP-9蛋白與TIMP-1之間平衡失調(diào)的狀態(tài)、減少內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的降解、保護(hù)血腦屏障、減輕血管源性腦水腫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)大、小劑量黃芪甲苷均可抑制腦缺血再灌注后腦組織IL-1β含量，從而減輕炎性反應(yīng)、抑制MMP-9蛋白的高表達(dá)、保護(hù)血腦屏障。另外，作為炎癥反應(yīng)重要的“調(diào)節(jié)劑”,MMP-9蛋白高表達(dá)的抑制又可進(jìn)一步發(fā)揮其正反饋?zhàn)饔?，減少炎癥因子的侵入，從而降低腦缺血再灌注后腦組織IL-1β含量。這可能是黃芪甲苷發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大劑量黃芪甲苷與小劑量黃芪甲苷比較，缺血再灌注后腦組織伊文氏藍(lán)含量、IL-1β含量及MMP-9蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異，說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)BBB的保護(hù)作用在一定范圍內(nèi)與劑量大小無(wú)關(guān)，機(jī)制尚不清楚，這可能與腦缺血再灌注后血腦屏障破壞與多因素調(diào)控有關(guān)。

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(2016-04-19收稿 2016-05-10修回)

Protective effects of astragaloside IV on blood-brain barrier and the content of IL-1β and expression of MMP-9 protein after cerebral ischemic reperfusion

QuYouzhi，YangZhen,LiMin,etal.

DepartermentofNeurosurgery，TangduHospital0fFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710038

Objective To investigate the protective effects of astragaloside IV on blood-brain barrier and the content of IL-1β, expression of MMP-9 protein after cerebral ischemic reperfusion.Methods 72 SD rats were divided randomly into four groups: sham-operated group, normal- saline contral group, group treated by low dose of astragaloside IV(10 mg/kg),group treated by high dose of astragaloside IV(20 mg/kg).Evans Blue(EB) leakage, the content of IL-1β,expression of MMP-9 protein were respectively detected by spectrophotometry, ELISA and immunohistochemistry.Results Compared with sham-operated group, EB leakage,the content of IL-1β and expression of MMP-9 protein were higher in normal- saline contral group (P<0.01).Compared with normal saline contral group, EB leakage,the content of IL-1β and expression of MMP-9 protein were lower in group treated by low dose of astragaloside Ⅳ and group treated by high dose of astragaloside Ⅳ(P<0.05). There was no statistical difference between group treated by low dose of astragaloside Ⅳ and group treated by high dose of astragaloside Ⅳ(P>0.05).Conclusion Astragaloside Ⅳ could have protective effects on blood-brain barrier after cerebral ischemic reperfusion. Its mechanisms may be associated with down-regulation of the content of IL-1β and expression of MMP-9 protein.

Astragaloside Ⅳ Cerebral ischemic reperfusion Blood-brain barrier IL-1β MMP-9

國(guó)家自然科學(xué)基金(30600841)

710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科

R743

A

1007-0478(2016)06-0389-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.001