山杏初代培養(yǎng)影響因素研究

劉曉光，徐巖巖，劉 璐，楊曉歌

（1.河北民族師范學(xué)院 化學(xué)系，河北 承德 067000；2.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 朝陽(yáng) 100124）

山杏初代培養(yǎng)影響因素研究

劉曉光1，徐巖巖1，劉 璐1，楊曉歌2

（1.河北民族師范學(xué)院 化學(xué)系，河北 承德 067000；2.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 朝陽(yáng) 100124）

以山杏幼嫩莖尖為外植體，研究在75%的酒精及75%酒精和升汞不同處理時(shí)間下，莖尖的污染率和成活率，以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，使用75%酒精（20 s）+0.1% HgC12（3 min）處理山杏外植體成活率最高；6-B A可有效促進(jìn)外植體的萌發(fā)，1.2mg·L-1時(shí)萌發(fā)率最高。6-B A 1.2mg·L-1與不同濃度的生長(zhǎng)素IBA和NAA組合，可促進(jìn)外植體的萌發(fā)生長(zhǎng)，萌發(fā)率最高為94.16%。山杏莖尖外植體初代培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+6-B A1.2mg·L-1+I B A1.0mg·L-1。

山杏；滅菌時(shí)間；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；初代培養(yǎng)

文獻(xiàn)著錄格式：劉曉光，徐巖巖，劉璐，等.山杏初代培養(yǎng)影響因素研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（1）：84-86.

山杏（Prunus sibiric）為薔薇科杏屬灌木或小喬木，主要分布在黑龍江、內(nèi)蒙古、河北等地區(qū)，是造林綠化的先鋒樹(shù)種，具有優(yōu)良的水土保持和防風(fēng)固沙功能，同時(shí)山杏具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。目前山杏栽培中的難題是優(yōu)良品種的利用，利用組織培養(yǎng)快速繁殖可獲得大量與母株性狀一致的無(wú)性系組培苗。本研究以山杏幼嫩莖尖為外植體，用酒精和升汞滅菌處理，探索出最適合的滅菌時(shí)間，篩選出適合山杏外植體滅菌的流程；探究6-BA濃度及與IBA和NAA濃度組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響，篩選出適宜的培養(yǎng)基，為山杏工廠化育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以山杏的幼嫩莖尖作為外植體，2014年7月采自承德市馮營(yíng)子鎮(zhèn)野生山杏林。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將采集后的幼嫩莖尖，剪去多余帶有木質(zhì)部的枝條，剩下的莖段具有嫩葉且長(zhǎng)度為2～3 cm，先用清水沖洗2～3次，再用流水沖洗30 min，然后將其放置在超凈臺(tái)上備用。

1.2.2 滅菌方式

酒精滅菌方法。選取沖洗好的外植體分別用以下5種方法進(jìn)行滅菌：質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡5 s；質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡10 s；質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡15 s；質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡20 s；質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡30s。滅菌后，分別用無(wú)菌水沖洗3次，然后將幼嫩莖尖的葉和多余的莖段切取，接種到MS培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種30株，重復(fù)3次。接種8 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、存活率、生長(zhǎng)情況。

升汞滅菌方法。選取山杏幼嫩莖尖作為外植體，在流水下沖洗30 min，用最適酒精滅菌時(shí)間進(jìn)行處理后，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞進(jìn)行滅菌處理。滅菌時(shí)間處理分別為：0.1% HgC12浸泡 1 min、0.1%HgC12浸泡 3min、0.1%HgC12浸泡5 min、0.1%HgC12浸泡7 min；隨后無(wú)菌水沖洗5次，將幼嫩莖尖接種在MS培養(yǎng)基中。每處理接種30株山杏外植體，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、存活率、側(cè)芽萌發(fā)率、生長(zhǎng)情況。

1.2.3 培養(yǎng)基

6-BA基本培養(yǎng)基。采用M S培養(yǎng)基+蔗糖30 g· L-1+瓊脂g·L-1。采用不同濃度6-B A進(jìn)行處理，濃度梯度設(shè)為0，0.4，0.8，1.2mg·L-1，接種20 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率、芽萌發(fā)天數(shù)、生長(zhǎng)情況。

6-BA分別與IBA和NAA組合處理。在對(duì)6-B A濃度的考察基礎(chǔ)上，將上一步所得到的最適宜的6-B A濃度分別與IBA和NAA組合處理，IBA和NAA濃度均設(shè)3個(gè)梯度：0，0.5，1.0mg·L-1。

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度24～26℃，光照強(qiáng)度設(shè)為2 500～3 000 1 x，光暗周期14/8 h，空氣相對(duì)濕度60%～70%，培養(yǎng)基的pH值5.8。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

在培養(yǎng)基中出現(xiàn)各種顏色的菌斑或外植體附近有黏液狀和發(fā)酵泡沫狀物質(zhì)或培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡，這些都視為污染植株。

生長(zhǎng)情況的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分3個(gè)等級(jí)：第一等級(jí)為山杏外植體葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)健壯，有新芽萌發(fā)（+++）；第二等級(jí)為組培苗葉色發(fā)黃，生長(zhǎng)緩慢（++）；第三等級(jí)為嫩葉或莖尖被褐化，莖段是綠色（+）。

外植體出現(xiàn)白化現(xiàn)象，不再生長(zhǎng)，整株組培苗全部嚴(yán)重褐化，無(wú)生命跡象視為死亡。

用Exce1和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精滅菌時(shí)間對(duì)山杏外植體成活率的影響

由表1得知，75%酒精對(duì)山杏外植體進(jìn)行滅菌處理，處理5～15 s，山杏外植體成活率逐漸下降，最低成活率僅50%。滅菌處理20 s時(shí)成活率達(dá)到最高，為 93.3%。滅菌處理30 s，成活率下降，為86.7%。其原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精滅菌會(huì)加大山杏莖尖細(xì)胞水分流失，導(dǎo)致山杏莖尖表面細(xì)胞脫水，進(jìn)而降低莖尖組織生物活性，導(dǎo)致成活率降低［1］。滅菌 15 s山杏外植體的死亡率最高，其次是5，10 s的滅菌處理，死亡率最低的滅菌處理是20，30 s。因?yàn)槎虝r(shí)間的滅菌處理不能殺死菌體，導(dǎo)致成活率下降。滅菌處理5～15 s，山杏莖尖生長(zhǎng)健壯，嫩芽萌發(fā)，葉色濃綠。20，30 s的滅菌處理因?yàn)榫凭L(zhǎng)時(shí)間的處理，破壞了莖尖組織細(xì)胞內(nèi)的生物活性，表現(xiàn)出葉色發(fā)黃，生長(zhǎng)緩慢的狀態(tài)，但不會(huì)導(dǎo)致外植體死亡。綜合考慮成活率、污染率、死亡率和生長(zhǎng)情況，用75%酒精滅菌處理20 s時(shí)效果最好。

表1 酒精滅菌時(shí)間對(duì)外植體成活率的影響

2.2 升汞滅菌時(shí)間對(duì)山杏外植體成活率的影響

用75%酒精滅菌20 s后，再用0.1%升汞處理。由表2可知，滅菌處理1，3 min萌芽效果高，達(dá)26.7%；滅菌處理5，7 min萌芽率較低。滅菌處理 1 min污染率最高，達(dá)40%；處理 3，5，7 min時(shí)，外植體污染率效果不顯著，污染率最低為0%。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸下降。山杏外植體的成活率最高的是滅菌3 min，成活率達(dá)93.3%；其次為1，5和7 min。觀察中發(fā)現(xiàn)，用0.1%升汞滅菌處理，山杏莖尖生長(zhǎng)狀況因升汞的影響，絕大多數(shù)莖尖褐化，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，處理1，3 min的莖尖，生長(zhǎng)狀況發(fā)生轉(zhuǎn)變，褐化部分長(zhǎng)出新的嫩芽，葉色也轉(zhuǎn)綠，但生長(zhǎng)仍緩慢。綜合考慮萌芽率、污染率、成活率、死亡率和生長(zhǎng)情況，用0.1%升汞對(duì)山杏外植體滅菌，最佳滅菌時(shí)間為3 min。

表2 升汞滅菌時(shí)間對(duì)山杏外植體成活率的影響

2.3 6-B A濃度對(duì)山杏外植體生長(zhǎng)的影響

在山杏初代培養(yǎng)基上添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-B A。由表3可知，6-B A濃度為0時(shí)，其萌芽率比0.4mg·L-1時(shí)的萌芽率高，但前者的萌芽天數(shù)為8 d，后者萌芽天數(shù)為4 d。空白培養(yǎng)基上外植體的萌發(fā)率為49.91%，芽生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)一般；使用6-B A處理，隨著濃度的升高，腋芽的萌發(fā)率依次升高，分別為39.65%，59.73%，74.92%，其中濃度為1.2mg·L-1時(shí)萌發(fā)率最高，長(zhǎng)勢(shì)最好。綜上，山杏初代培養(yǎng)用6-B A處理，最適宜的培養(yǎng)基為MS+1.2mg·L-16-B A。

表3 6-B A濃度對(duì)山杏外植體生長(zhǎng)的影響

2.4 6-B A與生長(zhǎng)素共同作用對(duì)山杏初代培養(yǎng)的影響

在山杏初代培養(yǎng)基上添加1.2mg·L-16-B A與不同的生長(zhǎng)素。

由表4可知，接種3～4 d時(shí)外植體開(kāi)始萌發(fā)，N A A處理比 I B A處理的外植體萌發(fā)早。20 d后，用6-B A與I B A共同處理的外植體萌發(fā)率為86.24%，94.16%；用6-B A與N A A共同處理的外植體萌發(fā)率為83.43%和83.8%，各處理間差異不顯著。4組處理中外植體均長(zhǎng)勢(shì)良好，30 d時(shí)腋芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯且部分出現(xiàn)增殖的現(xiàn)象。綜上，山杏初代培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+6-B A1.2mg· L-1+I B A1.0mg·L-1。

表4 6-B A與生長(zhǎng)素共同作用對(duì)山杏初代培養(yǎng)的影響

3 小結(jié)與討論

本研究以山杏幼嫩莖尖為植株材料，研究了不同滅菌時(shí)間對(duì)山杏外植體成活率的影響。結(jié)果表明，用75%的酒精（20 s）+0.1%HgC12（3 min）成活率最高。對(duì)山杏外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí)，最適宜的培養(yǎng)基為M S+6-B A1.2mg·L-1+I B A1.0mg·L-1，試驗(yàn)結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于鄭可等［2］的研究。

外植體是進(jìn)行組培時(shí)從植物體上切取下來(lái)的組織或器官［3］，通常采用75%酒精和0.1%升汞交叉對(duì)外植體進(jìn)行滅菌［4-5］。本試驗(yàn)得到的結(jié)果與齊高強(qiáng)等［6］和郭暉［7］的研究有所不同，用升汞滅菌的時(shí)間縮短1倍，但成活率仍能夠達(dá)到93%以上。山杏莖尖培養(yǎng)芽的分化多以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基［5］。本試驗(yàn)得到的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度較其他學(xué)者［7-9］研究略高。有研究表明，夏季氣溫較高，各類菌的活躍程度較高，污染率也高［10］。但山杏的新梢萌發(fā)快，只定于3-5月份采樣處理，時(shí)間短且任務(wù)重。雖本次試驗(yàn)的采樣時(shí)間在7月份，但試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)處理后的山杏莖尖的成活率、萌發(fā)率較高，生長(zhǎng)狀況良好。因此，為山杏外植體的培養(yǎng)延長(zhǎng)了采樣時(shí)間，更能夠應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

［1］苗玉青，李冠，吳松林，等.薄皮核桃組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（3）：503-507.

［2］鄭可，董勝君，田明芳，等.山杏組培繁殖技術(shù)［J］.北方園藝，2013（3）：115-118.

［3］李靜，王云德.西伯利亞百合鱗片組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.生物學(xué)通報(bào)，2012，47（4）：56-58.

［4］李建民，文清成，呂守城，等.大巖桐的組培快繁及其產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究［J］.北方園藝，2011（4）：153-154.

［5］朱廣廉.植物組織培養(yǎng)中的外植體滅菌［J］.植物生理學(xué)通訊，1996，32（6）：444-449.

［6］齊高強(qiáng)，趙忠，張存旭，等.大扁杏組培基本培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（3）：115-118.

［7］郭暉.大扁杏離體組織莖芽分化誘導(dǎo)試驗(yàn)［J］.平原大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，8（4）：122-125.

［8］田毅，王艷，趙宇瑛.凱特杏愈傷組織的誘導(dǎo)［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2006（9）：10-13.

［9］杜雪玲，余如剛，宋運(yùn)賢，等.“巴斗杏”組培快繁體系建立與耐鹽植株篩選［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2011，40（2）：34-38.

［10］馬琳，何麗娜，姜巖，等.鋸葉班克木外植體的選擇及消毒方法的研究［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（12）：134-137.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S665.1

A

0528-9017（2016）01-0084-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160132

2015-11-04

承德市財(cái)政局項(xiàng)目（CZ2014004）

劉曉光（1980-），女，河北石家莊人，博士，講師，從事野生植物資源開(kāi)發(fā)與利用方面的研究，E-mai1：zaosy126@126.com。