免疫磁納米粒子對腸炎沙門氏菌的富集分離

胡雨欣，鄭 舒，何 早，羅 芳，劉 霞*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

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免疫磁納米粒子對腸炎沙門氏菌的富集分離

胡雨欣，鄭 舒，何 早，羅 芳，劉 霞*
（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

摘 要：采用化學(xué)共沉淀法制備了羧基化磁納米粒子，分別對磁納米粒子-沙門氏菌多克隆抗體復(fù)合物（免疫磁納米粒子）的偶合條件和免疫磁納米粒子富集分離腸炎沙門氏菌的條件進行了優(yōu)化，為腸炎沙門氏菌的富集分離和檢測提供一種更為快捷、高效的方法。結(jié)果表明，當51.7 μg/mL羧基化磁納米粒子與碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺（0.4 mol/L/0.1 mol/L）、1.0 mg/mL的多克隆抗體的體積比為1∶2∶2時，37 ℃水浴加熱40 min，兩者的偶合效果最佳。應(yīng)用上述優(yōu)化條件制備的免疫磁納米粒子吸附104CFU/mL腸炎沙門氏菌，當兩者的體積比為4∶5，孵育時間為40 min時，免疫磁納米粒子對腸炎沙門氏菌的吸附效率可達到94.36%。

關(guān)鍵詞：免疫磁納米粒子；腸炎沙門氏菌；富集分離

引文格式：

胡雨欣， 鄭舒， 何早， 等.免疫磁納米粒子對腸炎沙門氏菌的富集分離［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 162-167.

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沙門氏菌是引起食物感染和食物中毒的最重要食源性致病菌之一，禽蛋和肉類食品是其主要的傳播媒介［1-2］。人食入過量活菌會產(chǎn)生腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴重者會出現(xiàn)敗血癥、脫水、酸中毒、無尿、心力衰竭等［3］，急救不及時將會危及生命。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第二位［4］，因而受到了人們強烈的關(guān)注，如何有效地解決沙門氏菌在食品中的污染是食品安全監(jiān)測工作中的重點之一。

現(xiàn)有分析檢測方法通常都需要復(fù)雜的增菌過程［5-8］，而對目標菌進行預(yù)增菌或高效分離富集是其實現(xiàn)快速檢測的重要前提。因此，選擇合適的富集分離方法，使目標菌從復(fù)雜的食品基質(zhì)中分離出來，同時清除食品基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，對實現(xiàn)目標菌靈敏且特異的檢測至關(guān)重要［9］。

近年來，基于磁性納米材料的免疫磁分離法（immunemagnetic separation，IMS）已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食源性致病菌的分離［10-14］。經(jīng)過生物學(xué)修飾和功能化的磁性納米材料，可特異性地識別食源性致病菌，再利用外加磁場分離菌體，即可實現(xiàn)食品中少量致病菌的特異性的快速富集分離［15-19］。本研究采用化學(xué)共沉淀法，制備了表面羧基修飾的功能化磁納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs），利用MNPs表面的羧基，通過氨基偶聯(lián)的方法將沙門氏菌多克隆抗體（anti-Salmonella polyclonal antibody，PAb）結(jié)合在MNPs的表面，制備出對腸炎沙門氏菌具有特異性吸附的免疫MNPs。利用該免疫MNPs對腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）進行富集分離，獲得吸附性能最佳的免疫MNPs的制備條件和吸附條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

腸炎沙門氏菌多克隆抗體（anti-Salmonella polyclonal antibody，PAb，ab35156） 美國Abcam公司；腸炎沙門氏菌（CICC21482） 湖南省食品藥品檢驗研究院。

富里酸、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醇胺（ethanolamine hydrochloride，EA）、碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國Sigma-Aldrich公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）（1 L PBS包含3.223 g磷酸二氫鈉、0.45 g磷酸氫二鈉和8 g氯化鈉，0.1 mol/L氫氧化鈉，pH 7.4），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；VORTEX-2旋渦振蕩儀 美國Scientific Industries公司；KQ-100超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；SPX-250BS-Ⅱ恒溫箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基化MNPs的制備

參考Zhou Chunjiao等［20］的方法，采用化學(xué)共沉淀法一步生成表面羧基化的MNPs。250 mL三口瓶中加入120 mL超純水，通入氮氣除盡氧氣后；升溫至80 ℃，再加入0.4 g富里酸；當溶液沸騰后立即加入20 mL含有2 mmol/L FeCl3·6H2O、1 mmol/L FeSO4·7H2O的混合溶液和5 mL 6.25 mol/L NaOH，回流100 min。待溶液冷卻至室溫后，經(jīng)磁性分離，多次純水與無水乙醇洗滌至中性，配成一定濃度溶液后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫MNPs制備條件的優(yōu)化

利用MNPs表面的羧基，經(jīng)氨基偶聯(lián)方法將PAb偶合在其表面，制備出對腸炎沙門殺菌具有特異性吸附的免疫MNPs。取PBS緩沖液稀釋的MNPs溶液（51.7 μg/mL）40 μL，利用新配制的EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）40 μL混合溶液活化其表面的羧基后，加入40 μL一定濃度的抗體稀釋液，漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min后，加入0.1 mol/L 40 μL EA漩渦振蕩5 min進行封閉，然后靜置30 min，經(jīng)外加磁場分離未結(jié)合的PAb，并用PBS反復(fù)洗滌3 遍，重懸至初體積。

1.3.2.1 PAb與羧基化MNPs偶合濃度的參考量的確定

以BSA為標準蛋白，配制一系列已知質(zhì)量濃度的BSA標準溶液。使用紫外分光光度計在波長278 nm處測定其吸光度，并繪制相應(yīng)的標準曲線，通過擬合線性關(guān)系獲得線性方程。然后取未知質(zhì)量濃度的BSA 2 mL，測定其在278 nm波長處的吸光度值（A1）；通過1.3.2節(jié)的方法與51.7 μg/mL羧基化MNPs結(jié)合后，經(jīng)外加磁場富集羧基化MNPs結(jié)合與BSA的偶合物，小心吸取上清液，測定其在278 nm波長處的吸光度值（A2）。通過測定BSA在被結(jié)合前后278 nm波長處的吸光度值，由線性方程計算出與該濃度的羧基化MNPs結(jié)合的BSA濃度，并以此作為腸炎沙門氏菌多克隆抗體與該濃度MNPs偶合的參考使用量［21］。

1.3.2.2 EDC/NHS添加量的確定

取30 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；分別加入30、40、50、60 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加入60 μL 1 mg/mL BSA，漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加入0.1 mol/L EA，漩渦振蕩5 min，PBS緩沖液定容至2 mL。靜置30 min后用紫外-可見分光光度計掃描紫外全波段光譜，根據(jù)258 nm波長處的吸光度，確定EDC/NHS的最佳添加比例。

1.3.2.3 PAb用量的確定

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；分別加入加20、30、40、60 μL 1.0 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS緩沖液定容至2 mL。靜置于37 ℃水浴中反應(yīng)一定時間后，用紫外-可見分光光度計掃描紫外全波段光譜，根據(jù)258 nm波長處的吸光度，確定PAb與羧基化MNPs的最佳體積比。

1.3.2.4 反應(yīng)環(huán)境的影響

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加20 μL 0.5 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS溶液定容至2 mL。分別靜置于37 ℃水浴和恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)一定時間后，用紫外-可見分光光度計掃描紫外全波段光譜，確定最適合的反應(yīng)環(huán)境。

1.3.2.5 反應(yīng)溫度的影響

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加20 μL 0.5 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS溶液定容至2 mL。分別靜置于37 ℃和20 ℃水浴中反應(yīng)一定時間后，用紫外-可見分光光度計掃描紫外全波段光譜，確定最適合的反應(yīng)溫度。

1.3.2.6 免疫MNPs 4 ℃保存效果

將51.7 μg/mL羧基化MNPs與1.0 mg/mL PAb偶合好之后放置于4 ℃冰箱保存，每天使用紫外-可見分光光度計測定其在波長258 nm處的吸光度值變化，以考察免疫MNPs在4 ℃條件下的保存效果。

1.3.3 免疫MNPs高效富集腸炎沙門氏菌

1.3.3.1 腸炎沙門氏菌的活化

接種凍藏的腸炎沙門氏菌菌株至50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃活化過夜。取活化好的菌液5 mL至滅菌離心管中，5 000 r/min離心5 min后小心去掉上清液，沉淀用PBS重懸至初體積，備用。

1.3.3.2 免疫MNPs用量對吸附效率的影響

無菌操作下，調(diào)節(jié)腸炎沙門氏菌菌液濃度為104CFU/mL。分別取上述制備的免疫MNPs 20、40、60、80、100 μL至1.5 mL離心管中，每管各加入100 μL菌液，37 ℃水浴中孵育40 min，磁性分離，取上清液100 μL于SS平板涂布計數(shù)，每個梯度平行3 次。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計數(shù)計算吸附效率，同時做空白對照。考察所制備的免疫MNPs對該沙門氏菌吸附效率的影響。

1.3.3.3 反應(yīng)時間對吸附效率的影響

無菌條件下，取100 μL 104CFU/mL沙門氏菌稀釋液于1.5 mL滅菌離心管中，加入80 μL上述制備的免疫MNPs，37 ℃分別孵育10、20、30、40、50、60 min，磁性分離，取上清液100 μL于SS平板涂布計數(shù)，每個梯度平行3 次。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計數(shù)計算吸附效率，同時做空白對照?？疾旆磻?yīng)時間對吸附效率的影響。

1.3.3.4 免疫MNPs富集沙門氏菌的吸附效率計算

將免疫MNPs富集分離腸炎沙門氏菌過后的上清液采取合適的稀釋度，取100 μL于SS平板涂布。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計數(shù)計算其吸附效率［22］。

式中：Ci為平板計數(shù)菌落數(shù)/（CFU/mL）；Ck為加入菌懸液濃度/（CFU/mL）；Vi為涂布取樣體積/mL；Vj為菌懸液及MNPs加入總體積/mL；Vk為菌懸液加入體積/mL；N為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧基化MNPs生物功能化的紫外表征

紫外光譜可用來表征抗體是否與MNPs相結(jié)合。圖1顯示了PAb、MNPs以及免疫MNPs的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)278 nm處的吸收峰為PAb的紫外特征吸收峰；MNPs （Fe3O4MNPs）無顯著的紫外特征吸收峰；258 nm處的吸收峰為免疫MNPs的紫外特征吸收峰。免疫MNPs的紫外特征吸收峰值出現(xiàn)藍移，可能與MNPs粒子的光吸收與散射以及與半導(dǎo)體材料本身具有的間接帶隙（indrect band gap）的特性有關(guān)［23-24］。

2.2 PAb在羧基化MNPs表面最佳偶合濃度參考量的確定

為節(jié)約實驗成本，本實驗采用BSA作為模擬蛋白，獲得PAb在羧基化MNPs表面最佳偶合濃度的參考量。BSA在278 nm波長處的標準曲線方程為Y=0.707 86X－0.013 1（R2=0.999 3）。圖2為根據(jù)1.3.2.1節(jié)進行操作，獲得的BSA與MNPs偶合前后的紫外光譜圖。通過圖2可知，BSA經(jīng)MNPs偶合前后，在278 nm處的吸光度值分別為0.828及0.154，可得與羧基化MNPs （51.7 μg/mL）偶合的BSA的吸光度值為ΔY=0.674，將該值帶入BSA的線性方程，可算得X≈0.971 mg/mL，即與51.7 μg/mL羧基化MNPs偶合的BSA的質(zhì)量濃度為0.971 mg/mL，以此作為PAb與MNPs偶合的參考使用量。

2.3 EDC/NHS添加量的確定

由圖3可知，當30 μL 51.7 μg/mL的MNPs溶液中加入EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）混合液活化其表面的羧基時，當添加量由30 μL增加至60 μL時，復(fù)合物的吸光度在不斷增加，說明MNPs表面的羧基活化程度隨著EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）混合液的增加而不斷增加。MNPs表面的羧基被活化的程度越大，與一定體積的PAb結(jié)合的就越多。因此，當51.7 μg/mL MNPs生物功能化時，選擇EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）與MNPs兩者的體積比為2∶1，以活化其表面的羧基。

2.4 PAb用量的確定

根據(jù)1.3.2.3節(jié)，獲得了不同體積比的PAb（1.0 mg/mL）與MNPs（51.7 μg/mL）結(jié)合的紫外光譜（圖3）。如圖4所示，當PAb使用量為MNPs（20 μL）的3 倍時，免疫MNPs的吸光度值最大，說明偶合的效果最好；但是與2 倍使用量下的吸光度值差別并不明顯。這說明PAb用量在MNPs的2 倍以上時，MNPs的表面基本已被BSA覆蓋；考慮到抗體較為昂貴，故選擇PAb（1.0 mg/mL）與MNPs（51.7 μg/mL）兩者的體積比為2∶1進行后續(xù)實驗。

2.5 反應(yīng)環(huán)境對免疫磁納米粒子形成的影響

根據(jù)1.3.2.4節(jié)，將51.7 μg/mL MNPs與1.0 mg/mL PAb按照最佳使用量，分別在37 ℃水浴和恒溫培養(yǎng)箱中進行偶合，每隔一定的時間進行紫外表征。在反應(yīng)過程中，PAb的特征峰不斷藍移，當二者偶合達穩(wěn)定狀態(tài)時，其特征峰藍移至258 nm處。如圖5所示，當MNPs與PAb在恒溫箱中反應(yīng)時，420 min才偶合完全，而二者在水浴中反應(yīng)，40 min即可完成偶合，時間縮短了10 倍。其原因可能是水浴加熱相比恒溫箱提供的空氣加熱，可以平穩(wěn)地加熱，對溶液的加熱具有接觸包裹性比較好的特點。因此，MNPs與PAb的偶合選擇在水浴中進行。

2.6 反應(yīng)溫度對免疫磁納米粒子形成的影響

根據(jù)1.3.2.5節(jié)方法，將51.7 μg/mL MNPs與1.0 mg/mL PAb按照最佳使用量，分別在37 ℃和20 ℃水浴中進行偶合，每隔一定的時間進行紫外表征。如圖6所示，在37 ℃水浴條件下，MNPs與PAb 40 min即可完成偶合，形成免疫MNPs，而在20 ℃水浴下偶合完成則需要60 min；且免疫MNPs在37 ℃條件下能達到比在20 ℃條件下更高的吸光度值。這說明在37℃水浴加熱條件下比在20 ℃時，兩者偶合的效率更高。其原因是PAb在37℃條件下具有更好的生物活性，能與羧基化的MNPs結(jié)合得更快、更好，故MNPs與PAb的偶合的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃。

2.7 免疫磁納米粒子4 ℃保存效果

將最佳偶合條件下獲得的免疫MNPs放置于4 ℃冰箱保存，每天使用紫外-可見分光光度計測定其258 nm處的吸光度值變化，以觀察其在4 ℃條件下的保存效果。如圖7所示，免疫MNPs在前8 d的吸光度值下降幅度較小，而在第9天出現(xiàn)了非常明顯的下降，說明該免疫MNPs在4 ℃冰箱中至少可保存一周。導(dǎo)致其保存效果降低的原因，可能是保存溫度、物理狀態(tài)、保存液的成分和抗體的光敏感性引起的PAb生物活性的降低，從而導(dǎo)致免疫MNPs的偶合度下降［25］。

2.8 免疫MNPs用量對吸附效率的影響

按照1.3.3.2節(jié)方法，記錄24 h之后上層清液的細菌生長狀態(tài)后，計算出吸附效率如圖8所示，5 個添加量的免疫MNPs對沙門氏菌的平行3 次吸附效率平均值分別為82.81%、86.56%、89.50%、95.32%、95.56%，隨著免疫MNPs使用量的增加使其對細菌的吸附能力增強。當免疫MNPs的使用量達到80 μL時，吸附效率達到95.32%，而100 μL的免疫MNPs的吸附效率僅比80 μL時增加0.24%，吸附效果未并達到顯著增加。考慮經(jīng)濟效益最優(yōu)原則，選擇80 μL免疫MNPs吸附100 μL沙門氏菌菌液（104CFU/mL）。通過類比可得，當最優(yōu)條件下制備的的免疫MNPs與104CFU/mL沙門氏菌菌液的體積比為4∶5時其吸附效率可達到95.32%。

2.9 反應(yīng)時間對吸附效率的影響

如圖9所示，6 個不同反應(yīng)時間的平行3 次吸附效率平均值分別為75.70%、85.58%、89.56%、94.36%、94.84%、94.84%，隨著免疫MNPs與沙門氏菌結(jié)合時間的增加，吸附效率不斷增加，當免疫MNPs吸附沙門氏菌反應(yīng)時間為40、50、60 min時，其吸附效率的平均值變化并不明顯，說明反應(yīng)時間達50 min時，該反應(yīng)體系能夠吸附最多數(shù)量的目標菌，吸附效率達到最大值94.84%，時間過短免疫MNPs與沙門氏菌結(jié)合不充分。而當反應(yīng)時間40 min時，吸附效率已經(jīng)達到94.36%，考慮到時間過長細菌有可能死亡或脫離免疫MNPs，故選擇40 min作為免疫MNPs吸附沙門氏菌的最佳時間。

3 結(jié) 論

免疫MNPs以其能快速、高效富集分離沙門氏菌的能力，具有巨大的實際應(yīng)用價值。本實驗采用化學(xué)共沉淀法制備了羧基化MNPs，通過對羧基化MNPs與PAb偶合及免疫MNPs高效富集分離腸炎沙門氏菌的條件進行優(yōu)化，進一步對免疫MNPs富集分離沙門氏菌的最佳效率進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在偶合羧基化MNPs與PAb的過程中，當加熱環(huán)境為37 ℃水浴加熱、羧基化MNPs （51.7 μg/mL）與EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）、PAb（1.0 mg/mL）的體積比為1∶2∶2時具有最佳偶合效率。再者，在免疫MNPs富集分離腸炎沙門氏菌（104CFU/mL）的研究中發(fā)現(xiàn)，當腸炎沙門氏菌稀釋液濃度為104CFU/mL、兩者的體積比為4∶5，孵育40 min時具有最大吸附效率，為94.36%。經(jīng)上述條件優(yōu)化后，大大提升了免疫MNPs富集分離沙門氏菌的能力，使其更加高效、便捷。

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中圖分類號：R155.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0162-06

收稿日期：2015-09-17

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303084）

作者簡介：胡雨欣（1990—），女，碩士，研究方向為食品安全與控制。E-mail：627649521@qq.com

*通信作者：劉霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向為食品分析，食品營養(yǎng)與安全。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com

Enrichment and Isolation of Salmonella enteritidis by Immune Magnetic Nanoparticles

HU Yuxin， ZHENG Shu， HE Zao， LUO Fang， LIU Xia*
（Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology， College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract:In this study， carboxyl-coated magnetic namoparticles （MNPs） were prepared using a chemical coprecipitation method.The coupling conditions for conjugates （immune MNPs） of MNPs and anti-Salmonella polyclonal antibody （PAb）were optimized， and then the application of immune MNPs in the enrichment and isolation of Salmonella enteritidis was evaluated， which will provide a more fast and effective way for the detection of Salmonella.The results showed that the optimal coupling of MNPs and PAb was achieved when the volume ratio of 51.7 μg/mL MNPs to 0.4 mol/L EDC-0.1 mol/L NHS to 1.0 mg/mL PAb was 1:2:2 in a water bath at 37 ℃ for 40 min.The adsorption efficiency attained 94.36% when the volume ratio between 51.7 μg/mL immune MNPs and 104CFU/mL S.enteritidis was 4:5， and the incubation time was 40 min.

Key words:immune magnetic namoparticles； Salmonella enteritidis； enrichment and separation