石瑾秋，盧健翔，李寶艷

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·論著·

血漿miR-451水平與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系

石瑾秋，盧健翔，李寶艷

目的：探討血漿微小RNA451（miR-451）與子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）的關(guān)系，并觀察miR-451對(duì)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移的作用。方法：選取2014年1月—2015年5月于深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院就診的EMs患者（EMs組）54例，正常對(duì)照組59例，采血并提取血漿總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time qPCR）檢測(cè)血漿miR-451的表達(dá)強(qiáng)度。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-451對(duì)異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用；采用損傷愈合實(shí)驗(yàn)探討過(guò)表達(dá)miR-451后異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移變化。結(jié)果：EMs患者血漿miR-451表達(dá)水平低于對(duì)照組［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］；過(guò)表達(dá)miR-451后EMs基質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)遷移活性下降［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］。結(jié)論：EMs患者血漿miR-451水平減低；miR-451可能通過(guò)抑制異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮作用。

子宮內(nèi)膜異位癥；微RNAs；子宮內(nèi)膜；聚合酶鏈反應(yīng)；miR-451

【Abstract】Objective:To analyze the level of plasmamiR-451 in patientswith endometriosis（EMs），and to investigate the effect of miR-451 on the proliferation and migration of the stromal cells cultured in vitro. M ethods：We recruited 54 cases of EMs and 59 healthy volunteers from January 2014 to May 2015 at People′s Hospital of Luohu District.Total RNA from plasma were extracted，and the expression of plasma miR-451 was analyzed with real-time qPCR.The proliferation viability of stromal cells was detected by CCK-8 assay，and migration by the wound-healing assay.Results：The level of plasma miR-451 in EMs patients was significantly lower than that in healthy volunteers［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］.Overexpression ofmiR-451 in the in vitro cultured stromal cells significantly inhibited the proliferation and migration of stromal cells［（1.00± 0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］.Conclusions：The level of plasmamiR-451 is lowered in patients with EMs.miR-451 may participate in the pathophysiologicalmechanism of EMs by the inhibition of proliferation and migration of ectopic stromal cells.

【Keywords】Endometriosis；MicroRNAs；Endometrium；Polymerase chain reaction；miR-451 （JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：282-284）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種常見(jiàn)的婦科疾病。該病是一種有侵襲行為的良性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，特別是對(duì)于育齡期婦女，該病可導(dǎo)致女性不孕癥，給患者造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)［1-3］。然而，目前EMs尚缺少令人滿(mǎn)意的治療方法。因此，研究并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)EMs的個(gè)體化治療有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來(lái)研究較多的生物活性分子。越來(lái)越多的研究表明miRNA與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。miRNA可通過(guò)靶向作用于mRNA來(lái)調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)，其主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，也可透過(guò)細(xì)胞膜分泌到血漿中。因此，檢測(cè)血漿miRNA的表達(dá)即可反映細(xì)胞內(nèi)調(diào)控狀態(tài)的變化。miR-451是一種EMs相關(guān)miRNA，其在多種疾病中表達(dá)發(fā)生顯著變化，如惡性腫瘤、炎癥等［6-7］。在EMs動(dòng)物模型中，miR-451的表達(dá)下調(diào)［8］。然而，miR-451在EMs患者血漿中的變化尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)EMs患者血漿中miR-451的表達(dá)，初步探討其作用機(jī)制，分析miR-451與EMs之間的相關(guān)性，為尋找EMs治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者單位：518001廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院婦科微創(chuàng)治療中心

通信作者：李寶艷，E-mail：szlby150@hotmail.com

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年1月—2015年5月于我院就診且病理學(xué)證實(shí)為EMs的患者（EMs組）54例（Ⅰ/Ⅱ期患者13例，Ⅲ/Ⅳ期患者41例），年齡（31.4±2.5）歲；另選取同期來(lái)我院體檢的健康志愿者（對(duì)照組）59例，年齡（28.5±3.8）歲。

1.2樣品收集與血漿m iRNA提取EMs患者血漿均取自月經(jīng)分泌期，采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管采集晨間血液，離心，分離血漿存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用mirVanaTMPARISKit試劑盒（Thermo Fisher）按照使用說(shuō)明提取血漿miRNA。加入線蟲(chóng)Cel-miR-39作為內(nèi)參。提取完畢后，檢測(cè)RNA濃度、稀釋至等濃度并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time qPCR）檢測(cè)血漿m iR-451的表達(dá)采用TaqMan探針real-time qPCR法分別檢測(cè)各樣品中miR-451及Cel-miR-39的表達(dá)，以miR-451相對(duì)Cel-miR-39的表達(dá)作為各樣品miR-451的相對(duì)表達(dá)量。以對(duì)照組miR-451的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，EMs組miR-451的表達(dá)以相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)表示。

1.4異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜組織取自經(jīng)病理證實(shí)為EMs的患者，經(jīng)手術(shù)切除巧克力囊腫組織后修剪周?chē)＝M織并刮取異位內(nèi)膜組織。并將組織剪碎經(jīng)Ⅰ型膠原酶于37℃下消化，將懸液進(jìn)行差速貼壁1 h，反復(fù)清洗并棄去未貼壁細(xì)胞。之后將貼壁細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（Thermo Fisher）繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn)將1.4中所述的EMs基質(zhì)細(xì)胞消化，接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后首先測(cè)定450 nm處0 h基準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值。之后采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分別將miR-451類(lèi)似物及陰性對(duì)照（Scramble）通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染EMs基質(zhì)細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后12，24，48 h后檢測(cè)各組450 nm處吸光度值。以0 h基準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值設(shè)為1，以各組吸光度的相對(duì)值反映相對(duì)增殖活力，并繪制增殖曲線。

1.6損傷愈合實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種至6孔板，采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分別將miR-451類(lèi)似物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入EMs基質(zhì)細(xì)胞中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后，采用無(wú)菌Tip頭劃痕，并在18 h后拍照觀察各組細(xì)胞的遷移情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件處理，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EM s患者血漿m iR-451表達(dá)下調(diào)EMs患者血漿miR-451下降至對(duì)照組的53%［（0.53±0.14）vs. （1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］。

2.2過(guò)表達(dá)m iR-451抑制EM s基質(zhì)細(xì)胞增殖采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-451后24，48 h，EMs基質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)增殖活性較陰性對(duì)照組降低（均P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1　過(guò)表達(dá)m iR-451后EM s基質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)增殖活性

2.3過(guò)表達(dá)m iR-451后抑制EM s基質(zhì)細(xì)胞的遷移損傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-451后EMs基質(zhì)細(xì)胞的遷移入劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)目明顯減少（見(jiàn)圖2A），過(guò)表達(dá)miR-451后EMs基質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)遷移活性較陰性對(duì)照組降低［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］，見(jiàn)圖2B。

3討論

miRNA是細(xì)胞內(nèi)有調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與多種疾病的進(jìn)程，因此探討miRNA對(duì)疾病的調(diào)控作用對(duì)揭示疾病的發(fā)病機(jī)制、設(shè)計(jì)新的治療靶點(diǎn)有重要意義。EMs是一種常見(jiàn)的婦科疾病，但其發(fā)病原因未知，目前尚無(wú)特效的治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在EMs患者血漿中降低，提示miR-451很可能在EMs中起重要的調(diào)控作用。

miRNA分子質(zhì)量小，容易通透出細(xì)胞膜并釋放進(jìn)入血中。因此，檢測(cè)血漿中miRNA的表達(dá)可反映出相應(yīng)細(xì)胞中調(diào)控的變化。miR-451具有重要的生理功能，其表達(dá)變化與多種疾病有關(guān)，如腫瘤、炎癥等［6-7］。然而，miR-451與EMs的關(guān)系至今尚存有爭(zhēng)議。在人類(lèi)和其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，EMs可導(dǎo)致miR-451的下調(diào)，同時(shí)伴有靶基因YWHAZ的上調(diào)［6］。而在小鼠EMs模型中，miR-451表達(dá)缺失小鼠比野生型小鼠EMs病灶更少，提示miR-451很可能是加重EMs的因素［9］。在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-451通過(guò)抑制遷移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）表達(dá)抑制上皮細(xì)胞的生存［10］。miR-451與細(xì)胞遷移、增殖等生物學(xué)過(guò)程有密切關(guān)系。以往研究表明，體外水平過(guò)表達(dá)miR-451可顯著抑制胃癌細(xì)胞遷移［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-451過(guò)表達(dá)可減弱EMs基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移活性。因此，上述結(jié)果共同提示，miR-451在不同種屬的動(dòng)物模型中可能發(fā)揮不同的作用，且miR-451在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中所起的調(diào)控作用不同。

miR-451的靶點(diǎn)較多，目前已被證實(shí)的與EMs相關(guān)的靶基因包括YWHAZ、MIF和纖維蛋白原α （fibrinogenα，F(xiàn)GA）異構(gòu)體2［6，12-13］。但是這些靶基因如何進(jìn)一步調(diào)控EMs的進(jìn)展尚需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在EMs患者血漿中下調(diào)，并可通過(guò)抑制EMs基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移參與EMs的調(diào)控。綜上，miR-451是重要的EMs相關(guān)miRNA，然而miR-451在EMs中的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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［本文編輯王琳］

The Relationship between Plasma m iR-451 and Endometriosis

SHI Jin-qiu，LU Jian-xiang，LI Bao-yan.The Minimally Invasive Center，Department of Gynecology，The People′s Hospital of Luohu District，Shenzhen 518001，China

LIBao-yan，E-mail：szlby150@hotmail.com

（2016-04-14）