王谷仙 孫淑艷

（曲靖醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，云南 曲靖 655011）

基因優(yōu)化分析

王谷仙 孫淑艷

（曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，云南 曲靖 655011）

遺傳密碼子的研究重心已由遺傳密碼子的破譯及反常密碼子的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入到遺傳密碼子的起源與進(jìn)化及擴(kuò)張等研究。遺傳密碼子的起源與進(jìn)化是當(dāng)今基因組學(xué)研究的熱點命題之一，相關(guān)的學(xué)說、假設(shè)層出不窮，但尚未取得實質(zhì)性突破。另一方面，無義密碼子的再定義及遺傳密碼的擴(kuò)張等研究卻極大的豐富和發(fā)展了遺傳密碼子的科學(xué)內(nèi)涵，推動了生命科學(xué)研究的發(fā)展。

遺傳密碼子；基因優(yōu)化

一、人Hexastatin基因的優(yōu)化、蛋白的表達(dá)純化及初步應(yīng)用

新血管生成是各種生理和病理過程發(fā)生的基礎(chǔ)。在胚胎形成和胎盤發(fā)育等正常生理過程中，新血管的生成是至關(guān)重要的；然而對于一些疾病的產(chǎn)生，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，同樣離不開新血管生成的作用。1971年Folkman提出了“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”的觀點，抑制腫瘤新生血管的形成，將會阻斷腫瘤細(xì)胞賴以生存的氧氣及營養(yǎng)供給，繼而造成腫瘤細(xì)胞的凋亡。此學(xué)說的提出為腫瘤的生物治療提供了新的策略。由于內(nèi)源性血管生成抑制因子顯示出抑制瘤床內(nèi)皮細(xì)胞增殖的高度選擇性，因此被認(rèn)為是抗血管生成治療中最有潛力的藥物蛋白質(zhì)，尋找內(nèi)源性的血管生成抑制因子成為近年來研究的熱點。Hexastatin是一種新型的腫瘤血管生成抑制劑，它來源于Ⅳ型膠原蛋白α6鏈的非膠原區(qū)NC1，由229個氨基酸組成，分子量是25kD。近年來有研究證實Hexastatin具有抑制腫瘤新生血管生成和抗腫瘤的活性的作用。實驗研究表明，編碼a6鏈的COL4A6基因的異常表達(dá)與腫瘤的形成有直接關(guān)系；同時還有研究發(fā)現(xiàn)Hexastatin在癌組織中含量的下調(diào)可以作為腫瘤浸潤的重要指標(biāo)，這些都起到預(yù)警的作用。本研究優(yōu)化并合成人Hexastatin基因，然后與pET28a表達(dá)載體連接，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的條件。在超聲破碎細(xì)菌和包涵體后，利用Ni-NTA層析柱純化蛋白，用SDS-PAGE和Western blot分析，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞的MTT活性實驗。實驗結(jié)果：成功構(gòu)建了pET28aseq702表達(dá)質(zhì)粒，并在BL21菌體中獲得高效可溶性表達(dá)，表達(dá)的可溶性Hexastatin蛋白占總蛋白量的45.1%，純化后的人Hexastatin蛋白的純度可達(dá)90%，濃度為160.24μg/ml；Western blot證實表達(dá)蛋白為目的蛋白；人Hexastatin蛋白對腫瘤細(xì)胞C6、MCF-7以及HMEC細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，抑制率分別高達(dá)72.9%±3.6、48.8%±2.9、52.7%±2.5，對照組相比均有顯著性差異，P〈0.05。本研究成功地表達(dá)了優(yōu)化的人Hexastatin蛋白，證實了人Hexastatin蛋白對腫瘤細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用，為腫瘤的抗血管療法提供了新途徑。

二、人Mn-SOD基因及其優(yōu)化序列在畢赤酵母中的表達(dá)

提取人肝總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增出了Mn-SOD相應(yīng)的基因片段，與載體相連后導(dǎo)入畢赤酵母中。根據(jù)酵母偏愛密碼子對基因序列進(jìn)行優(yōu)化處理后的基因序列也導(dǎo)入畢赤酵母中。對這兩種工程菌產(chǎn)SOD情況進(jìn)行對比實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過基因序列優(yōu)化的工程菌在產(chǎn)酶能力上具有更大的優(yōu)勢，這表明在基因序列表達(dá)中序列優(yōu)化具有重要作用。

三、基因設(shè)計對重組蛋白表達(dá)的影響研究進(jìn)展

研究者發(fā)現(xiàn)并非所有的基因都能在異源宿主中高效表達(dá)，除了宿主、分泌途徑、啟動子等因素外，基因自身的序列也蘊含了多種影響蛋白表達(dá)的因素，如密碼子偏愛性，密碼子對偏愛性，GC含量，mRNA二級結(jié)構(gòu)，mRNA穩(wěn)定性等。從基因設(shè)計的角度對影響蛋白表達(dá)的因素和方法進(jìn)行了綜述，尤其是對密碼子優(yōu)化和密碼子對優(yōu)化，詳細(xì)討論了與傳統(tǒng)基因優(yōu)化理念截然不同的密碼子協(xié)調(diào)化及密碼子對協(xié)調(diào)化等最新進(jìn)展。 更多還原

［1］唐曉芬，陳莉，馬玉韜.密碼子使用偏性量化方法研究綜述［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué).2013（05）

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1671-864X（2016）07-0281-01