呂 鑫，隋 昕，李萬(wàn)華，聶志勇，王永安（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

大鼠動(dòng)態(tài)吸入氯吡硫磷染毒模型的建立及致傷效應(yīng)評(píng)價(jià)

呂 鑫，隋 昕，李萬(wàn)華，聶志勇，王永安
（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

目的 建立大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入有機(jī)磷農(nóng)藥氯吡硫磷（CPF）的染毒模型，探討SD大鼠急性吸入CPF致傷效應(yīng)。方法 通過(guò)優(yōu)化氣溶膠發(fā)生參數(shù)，建立大鼠急性吸入CPF的動(dòng)態(tài)暴露環(huán)境；利用吸附采樣-氣相檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)CPF的濃度，利用粒徑監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)CPF的粒徑，同時(shí)考察氣溶膠的濃度和粒徑隨時(shí)間的變化；采用Bliss法，將SPF級(jí)雄性SD大鼠置于染毒環(huán)境中進(jìn)行染毒，在不同濃時(shí)積（Ct）下觀察染毒過(guò)程中大鼠的癥狀，記錄染毒后各濃度組大鼠10 d內(nèi)的死亡情況；同時(shí)根據(jù)半數(shù)致死Ct （LCt50），檢測(cè)不同暴露濃度染毒后不同時(shí)間點(diǎn)血漿膽堿酯酶（ChE）活性變化。結(jié)果 暴露艙內(nèi)CPF氣溶膠濃度在9個(gè)時(shí)間段的平均值為160.6 mg·m-3，變異系數(shù)（RSD）為6.9%；氣溶膠粒徑幾何平均值為1.1 μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8，符合國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織急性吸入染毒技術(shù)要求。在此染毒條件下，SD大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒的LCt50為1654.2 mg·m-3·h，隨著染毒濃度的增加，血漿ChE活性抑制愈加明顯（P＜0.05）。結(jié)論 本研究成功建立了大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入CPF染毒模型，為有機(jī)磷類(lèi)工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品以及神經(jīng)性毒劑吸入致傷和防治研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和技術(shù)支撐。

氯吡硫磷；氣溶膠；半數(shù)致死濃時(shí)積

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.009

氯吡硫磷（chlorpyrifos，CPF），也叫毒死蜱，是一種廣譜高效、低抗藥性的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑（organo?phosphate pesticides，OP），是全球使用量最多的農(nóng)藥之一，被廣泛應(yīng)用于防制水稻、花生、大豆和小麥等多種作物上的害蟲(chóng)和螨類(lèi)，同時(shí)也用于庭院或居家滅蟲(chóng)。但是，給人們提供便利的同時(shí)，它也帶來(lái)了次生和潛在的威脅。首先，CPF過(guò)量使用，尤其在發(fā)展中國(guó)家，農(nóng)民普遍超高濃度進(jìn)行噴灑作業(yè)，其降落在植物表面和地面的農(nóng)藥會(huì)產(chǎn)生二次揮發(fā)等次生危害［1-2］。其次，CPF廣泛應(yīng)用于居家環(huán)境中［3］，使人群處于長(zhǎng)期持續(xù)暴露狀態(tài)，降低人群免疫力，引起哮喘［4］和遲發(fā)性神經(jīng)疾?。?-6］等，這些問(wèn)題正逐漸引起醫(yī)學(xué)界和普通民眾的關(guān)注。另外，農(nóng)藥在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中一旦發(fā)生意外泄露，或遭到恐怖襲擊等［7-8］情況，會(huì)使周?chē)巳憾虝r(shí)間內(nèi)處于高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的急性暴露環(huán)境中，使生命健康受到威脅。

建立現(xiàn)場(chǎng)模擬的吸入染毒模型，進(jìn)行生物致傷效應(yīng)評(píng)價(jià)及防治措施研究，是有效應(yīng)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥急性暴露等突發(fā)化學(xué)事件的一種有效手段。但由于吸入染毒對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、裝置及釋放技術(shù)均有較高要求［9-10］，且在染毒濃度上要做到均一、穩(wěn)定、可控，染毒粒徑要符合一定規(guī)范文件，如經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）的要求，所以優(yōu)效的暴露吸入染毒一直是國(guó)際性難題。本研究在前期工作［11］的基礎(chǔ)上，通過(guò)多次優(yōu)化CPF急性吸入染毒的關(guān)鍵性技術(shù)，建立了大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入CPF染毒模型，明確了暴露艙內(nèi)濃度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)及粒子粒徑等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，最終確定急性吸入中毒半數(shù)致死濃時(shí)積（median lethal concentration time，LCt50）；并通過(guò)檢測(cè)大鼠膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）活性進(jìn)一步對(duì)其致傷效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑和儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠130只，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。CPF水乳劑（40%，山東省青島東生藥業(yè)有限公司），CPF標(biāo)準(zhǔn)品（96%，北京伊諾凱科技有限公司），甲醇、甲苯和丙酮（分析純，國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水由本實(shí)驗(yàn)室提供。TSE全身暴露裝置（process control inhalation 700400 series），700800-PA-100粒徑監(jiān)測(cè)儀（均德國(guó)TSE公司），GC-FID，7890A氣相色譜儀-氫火焰燃燒檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司），氣體采樣器（SKC-800，德國(guó)），HRH-TIP-286液體定量推進(jìn)器（惠榮和公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（予華儀器有限責(zé)任公司），砂芯漏斗（100 mL-G1，河南三順教學(xué)儀器有限公司）。

1.2CPF標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及工作曲線的繪制

取96%CPF標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，溶于25 mL甲醇溶液中，配成1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別逐級(jí)稀釋為x=10，15，20，30，40和50 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)。儀器條件：進(jìn)樣口溫度280℃，N2流速2.5 mL·min-1，隔熱吹掃3 mL·min-1，不分流進(jìn)樣；檢測(cè)器FID溫度為290℃，H2流速30 mL·min-1，空氣流速400 mL·min-1，尾氣吹掃25 mL·min-1，程序升溫100℃保持1 min，20℃·min-1至280℃，保持1 min；每次進(jìn)樣1 μL，計(jì)算色譜峰面積y，繪制其與濃度關(guān)系的工作曲線。

1.3全身動(dòng)態(tài)染毒吸入模型的建立

1.3.1CPF氣溶膠態(tài)發(fā)生

將40%CPF水乳劑用砂芯漏斗抽濾去除其中粒徑較大的雜質(zhì)，用蒸餾水將其稀釋至30%，用雙筒液體定量推進(jìn)器吸取30%CPF水乳，設(shè)置推進(jìn)速率3 mL·min-1，氣溶膠化速率為20 L·min-1，稀釋氣體速率30 L·min-1，液體氣溶膠化后進(jìn)入暴露艙染毒，暴露艙壓力為-0.1 Pa。

1.3.2氣溶膠粒徑與濃度的檢測(cè)

基于氦氖激光技術(shù)，應(yīng)用粒徑檢測(cè)儀，設(shè)置采集速率為100 mL·min-1，監(jiān)測(cè)CPF氣溶膠粒子空氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)；同時(shí)，用9 mL混合溶劑（甲醇∶甲苯∶丙酮=2∶2∶1）作為吸附劑，利用吸附采樣技術(shù)，采集暴露艙內(nèi)氣溶膠，采集時(shí)間（t）為10 min，采集速率（r）為120 mL·min-1，采集液回收定容（V1）10 mL后用GC-FID進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)得數(shù)據(jù)代入工作曲線得到CPF溶液濃度c1（mg·L-1）；根據(jù)下面公式得到暴露艙內(nèi)CPF氣溶膠濃度c2（mg·m-3）。公式為c2= c1V1/rt。

1.3.3半數(shù)致死量的測(cè)定

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定30%CPF吸入染毒最大安全時(shí)間（Dn）為5 h，全部大鼠死亡的最短時(shí)間（Dm）為20 h，在Dn和Dm間取5個(gè)濃度組，根據(jù)Bliss法，染毒濃度間公比為，采用固定染毒濃度，不同染毒時(shí)間即5，7，10，14和20 h，將50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，單籠放入艙中進(jìn)行全身暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒。染毒結(jié)束后取出，觀察并記錄10 d內(nèi)各組大鼠的死亡情況，根據(jù)各組死亡率，用Bliss法計(jì)算SD雄性大鼠CPF氣溶膠吸入中毒的LCt50等致傷效應(yīng)參數(shù)。

1.4ChE活性測(cè)定

將72只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，每組24只，分別于0.2，0.4和0.8 LCt50濃度下進(jìn)行全身暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒；另取8只SD雄性大鼠作為正常對(duì)照組，正常暴露于相同溫度和濕度的空氣中。染毒結(jié)束后取出，分別在染毒后8 h，1，2及7 d剪尾采全血，正常對(duì)照組大鼠同樣操作。血樣肝素抗凝，825×g離心10 min，取上層血漿于-80℃冷凍保存。由國(guó)家北京藥物安全評(píng)價(jià)研究中心檢測(cè)ChE活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1全身動(dòng)態(tài)染毒吸入模型的評(píng)價(jià)

2.1.1氣溶膠粒徑大小

粒徑監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)TSE全身暴露裝置中CPF粒徑大小和氣溶膠濃度。圖1結(jié)果顯示，在7.7 s內(nèi)，測(cè)定氣溶膠總體積為12.8 mL，總粒子數(shù)為3.4×105，CPF氣溶膠粒徑平均值為1.3 μm，眾數(shù)值為1.3 μm，幾何平均值為1.1 μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.8，最高峰粒子數(shù)為15 850，無(wú)第2和第3峰值，符合正態(tài)分布規(guī)律。

Fig.1 Particle size of chlorpyrifos（CPF）aerosol in TSE whole-body exposure chamber.

2.1.2氣溶膠濃度穩(wěn)定性

根據(jù)2.1.1氣相色譜結(jié)果，做出工作曲線y= 7.019x-11.48，R2=0.999。將樣品峰面積代入工作曲線得出CPF溶液濃度c1（mg·L-1），根據(jù)公式計(jì)算出CPF氣溶膠平均濃度c2=（160.6±11.1）mg·m-3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation value，RSD）為6.9%。氣溶膠態(tài)CPF不同時(shí)間內(nèi)濃度及RSD如表1。

Tab.1　Concentration of CPF aerosol at different points of exposure time

2.2大鼠急性吸入CPF中毒情況

2.2.1中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，染毒開(kāi)始15 min后大鼠表現(xiàn)出流涎癥狀，隨后出現(xiàn)流淚、精神萎靡、肌顫、行動(dòng)困難等有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒體征。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，上述癥狀愈明顯，同時(shí)還出現(xiàn)眼鼻出血、呼吸困難、抽搐及死亡等現(xiàn)象。不同濃度染毒結(jié)束后，大鼠行動(dòng)困難，無(wú)法正常進(jìn)食飲水，其中5 h染毒組在24 h后飲食可恢復(fù)正常，染毒時(shí)間越長(zhǎng)恢復(fù)愈加緩慢，各組存活大鼠在3 d后基本恢復(fù)正?；顒?dòng)。

2.2.2半數(shù)致死濃時(shí)積（LCt50）

不同濃度組不同時(shí)間大鼠死亡情況如表2所示。根據(jù)表2結(jié)果，利用Bliss法計(jì)算得出大鼠急性吸入CPF致傷效應(yīng)參數(shù)。其中，LCt50為1654.3 mg·m-3·h，LCt50的95%可信限=1376.2～1995 mg·m-3·h-1，LCt5為907.5 mg·m-3·h，LCt95為3015.6 mg·m-3·h。

2.3大鼠急性吸入CPF后全血ChE活性變化

通過(guò)對(duì)不同LCt50下CPF染毒后各采樣點(diǎn)測(cè)得的ChE活性分析來(lái)看，0.2，0.4和0.8 LCt503組染毒后8 h，1和2 d的ChE活性與正常對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.05）；第7天ChE活性恢復(fù)接近正常值。其中前2組ChE活性呈先降后升趨勢(shì)，0.8 LCt50組ChE活性由最低值呈逐漸上升趨勢(shì)。ChE活性的抑制和大鼠染毒后癥狀恢復(fù)情況相一致，隨著染毒濃度的增加大鼠中毒癥狀逐漸加重，其中0.8 LCt50組大鼠恢復(fù)最慢（表3）。

0.2和0.4 LCt50組染毒后各采樣點(diǎn)中ChE抑制最低值出現(xiàn)在染毒后第1天，抑制率分別為69.2% 和78.0%；0.8LCt50組ChE抑制最低點(diǎn)為染毒后8 h，抑制率為85.2%。0.8 LCt50組染毒ChE活性最低為（13.5±1.85）U·L-1，明顯低于另2組ChE活性最低值分別為28±2.11和（20±2.45）U·L-1（P＜0.05）。

Tab.2 Deaths of rats at different concentrations after CPF acute inhalation exposure

Tab.3 Plasma cholinesterase（ChE）activity of rats at different times and concentrations after CPF acute inhala?tion exposure

3　討論

建立一種穩(wěn)定可控的現(xiàn)場(chǎng)模擬吸入染毒模型，評(píng)價(jià)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的致傷效應(yīng)，能更好地對(duì)其進(jìn)行防治研究。本研究通過(guò)選擇和調(diào)節(jié)CPF水乳劑推進(jìn)速度、空氣流速、氣溶膠化速率等條件，實(shí)現(xiàn)了CPF氣溶膠粒徑平均值（1.3 μm）、眾數(shù)值（1.3 μm）、幾何平均值（1.1 μm）相近，呈正態(tài)分布規(guī)律，證明實(shí)驗(yàn)中粒子大小均勻，符合OECD 403/433急性吸入毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則要求，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［11］，暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度隨時(shí)間的變化保持穩(wěn)定（160.6± 11.1）mg·m-3，RSD＜7%，證明暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度達(dá)到了穩(wěn)定可控。

本研究中，大鼠急性暴露動(dòng)態(tài)吸入致傷效應(yīng)參數(shù)結(jié)果顯示，LCt5和LCt50等數(shù)值較大，一方面證明CPF是一種中低毒有機(jī)磷農(nóng)藥，使用安全性高；另一方面也可能與CPF進(jìn)入大鼠體內(nèi)后吸收代謝較快有關(guān)。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的CPF最高暴露濃度為0.6 mg·m-3，但在實(shí)際使用過(guò)程中，CPF氣溶膠往往遠(yuǎn)大于此濃度。另外，泄露、恐襲等突發(fā)事件，使得有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥瞬時(shí)產(chǎn)生超高濃度，在短時(shí)間內(nèi)威脅暴露范圍內(nèi)人群的健康安全，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡，CPF急性吸入染毒模型的建立及致傷機(jī)制的研究可有效應(yīng)對(duì)此類(lèi)情況，并對(duì)模擬實(shí)戰(zhàn)有一定技術(shù)支撐意義。

CPF是一種廣譜有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，動(dòng)物中毒后抑制ChE，使突觸乙酰膽堿蓄積，主要引起神經(jīng)毒性，表現(xiàn)膽堿能神經(jīng)中毒的癥狀，如大量流涎、流淚、排尿、排便、共濟(jì)失調(diào)和震顫等。已知研究表明，動(dòng)物CPF中毒后的神經(jīng)行為及ChE抑制，與急性暴露的CPF濃度有關(guān)，濃度越高，癥狀越明顯［12］。一般情況下，當(dāng)腦ChE抑制＞60%時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)膽堿能中毒癥狀［13］。從濃度-效應(yīng)關(guān)系分析，ChE抑制被認(rèn)為是反映CPF毒性的最敏感的指標(biāo)［14］。

染毒后動(dòng)物血漿ChE活性呈緩慢恢復(fù)，其最佳理論峰值與機(jī)體代謝物水平有關(guān)，不同性別、日齡均有差異，因此采樣時(shí)間的選擇及對(duì)照組數(shù)值的測(cè)量存在一定的不確定性。本研究選取的時(shí)間點(diǎn)反映的ChE變化情況，有助于了解暴露于不同濃時(shí)積與動(dòng)物狀態(tài)及ChE值的變化趨勢(shì)，一定程度上呈正相關(guān)。

本研究對(duì)0.2，0.4和0.8 LCt503個(gè)濃度下CPF氣溶膠吸入染毒后8 h，1，2和7 d等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠血漿ChE活性變化進(jìn)行了測(cè)定，以確定染毒時(shí)間對(duì)血漿中ChE的抑制規(guī)律，為用藥治療尋找合適時(shí)間點(diǎn)。0.2 LCt50和0.4 LCt50組ChE的抑制峰值出現(xiàn)在染毒結(jié)束后1 d；0.8 LCt50組的采樣時(shí)間點(diǎn)是在染毒結(jié)束后8 h。但從ChE變化規(guī)律分析，理論上8 h采樣點(diǎn)前某一時(shí)間點(diǎn)應(yīng)有一相對(duì)高值，以后將對(duì)此作進(jìn)一步研究證明。CPF 0.8 LCt50暴露水平誘導(dǎo)約85.2%的ChE抑制，ChE活性和CPF全身暴露水平之間存在生理藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)的模型關(guān)系［15］。暴露濃度影響整個(gè)機(jī)體組織的ChE抑制情況，不同部位（腦、紅細(xì)胞和血漿等）ChE抑制與各種因素有關(guān)，如毒物吸收、分布、代謝、排泄及個(gè)體差異等。

本研究成功建立了CPF氣溶膠吸入染毒模型，為CPF吸入染毒致傷效應(yīng)及防治研究提供了染毒濃度依據(jù)，為高毒化學(xué)品及化學(xué)戰(zhàn)劑動(dòng)態(tài)暴露吸入染毒模型的建立提供了參考，并為高毒化學(xué)品吸入毒理學(xué)研究提供了技術(shù)支撐。

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本文編輯：齊春會(huì)）

Model establishment and injury assessment of chlorpyrifos dynamic-inhalation of rats

LYU Xin，SUI Xin，LI Wan-hua，NIE Zhi-yong，WANG Yong-an
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Toxicology and Pharmacology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To establish a model for chlorpyrifos（CPF）whole-body dynamic inhalation exposure in SD rats and investigate the injury effects after acute exposure by CPF.METHODS By optimizing the aerosol parameters，the animal acute dynamic inhalation exposure of CPF was established. Absorption sampling-gas phase detecting technology was used to monitor the concentration of CPF in the whole-body dynamic-inhalation exposure cabin by exploring the relationship between the concentration，particle size of CPF aerosol and the CPF inhalation time in the exposure cabin via a particle size detector. Using Bliss method，specific pathogen free SD male rats were allocated to the environment of CPFexposure at different lethal concentrations and time points.The symptoms and deaths of these SD male rats in different groups were recorded within the following 10 d.Based on the median lethal concentra?tion time（LCt50），the values of plasma cholinesterase（ChE）were checked at different time points after being exposed at different doses.RESULTS The mean concentrations of CPF aerosol at nine time points was 160.6 mg·m-3，the relative standard deviation value was 6.9%；the geometrical mean of aerosol particle size was 1.1 μm，and the geometric standard deviation was 1.8.The results met the technical requirements of Organization for Economic Cooperation and Development regarding acute inhalation exposure.Under these equipment conditions，the LCt50of CPF acute inhalation of SD male rats was 1654.2 mg·m-3·h，suggesting that plasma ChE inhibitory rate was higher with the increase in the exposing dose，and that there was a significant difference as compared with the controls（P＜0.05）.CONCLU?SlON The model for whole-body dynamic-inhalation exposure of CPF is applicable to rats，which can serve as an experimental platform and technical support to inhalation vulnerability and the research on prevention and cure of organophosphate industrial products and nerve agents.

chlorpyrifos；aerosol；median lethal concentration time

NIE Zhi-yong，E-mail：niezhiyong2008@163.com；WANG Yong-an，Tel：（010）66874607，E-mail：yonganw@sina.com

R966

A

1000-3002-（2016）04-0356-06

呂 鑫，女，碩士研究生，主要從事軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)研究，E-mail：pinkmoonlx@163.com

聶志勇，E-mail：niezhiyong2008@163.com；王永安，Tel：（010）66874607，E-mail：yonganw@sina.com

2015-08-17接受日期：2016-04-05）（