馬小珍 童文彬 劉李 曹冉冉 陳娜

610041成都，四川省疾病預(yù)防控制中心

2007-2014年柯薩奇病毒B5四川分離株的基因特征分析

馬小珍 童文彬 劉李 曹冉冉 陳娜

610041成都，四川省疾病預(yù)防控制中心

目的 了解2007-2014年四川省急性弛緩性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例中柯薩奇病毒B組5型（Coxsackie virus B5，CVB5）的基因特征。方法 對(duì)四川省2007～2014年AFP病例中分離到的10株CVB5進(jìn)行全VP1區(qū)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈（RT-PCR）反應(yīng)擴(kuò)增和核苷酸序列測(cè)定，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行基因特征分析。結(jié)果 10株分離株均為D基因型，與CVB5原型株（Fau1kner株）之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為80.4%～81.9%和95%～97.1%。2014年1株資陽分離株和1株成都分離株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致，1株南充分離株和1株宜賓分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性均為100%。結(jié)論 2007-2014年四川地區(qū)AFP病例中分離到的CVB5為D基因型，且遺傳特性較為穩(wěn)定。

【主題詞】 急性馳緩性麻痹；柯薩奇病毒B組5型；基因特征分析

腸道病毒（EV）隸屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，為單股正鏈的無包膜RNA病毒，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒及新型腸道病毒，根據(jù)生物學(xué)及遺傳特性分為（A、B、C、D）4個(gè)組［1］。EV感染可引起麻痹性疾病、無菌性腦膜炎、心肌疾病、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎、肝炎、出疹性疾病、嬰兒腹瀉和胰島素依賴型糖尿病等多種疾病，還可引起一些諸如發(fā)熱等類似感冒的綜合病癥［2，3］。多數(shù)HEV都可引起肢體麻痹，特別是脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒和?？刹《?，其中脊髓灰質(zhì)炎病毒感染后可造成肌張力減弱、肌力下降、腱反射減弱或消失，留下嚴(yán)重后遺癥；柯薩奇病毒和?？刹《九c脊髓灰質(zhì)炎病毒臨床癥狀相似，但較脊灰發(fā)病輕，一般沒有殘留麻痹。

柯薩奇 B組病毒（Coxsackieviruses group B，CVB）分為CVB1～CVB6六個(gè)血清型，均能在人群中引起小范圍的流行，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)CVB和一些慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)?？滤_奇病毒B5（CVB5）感染可引起多種人類疾病，包括無菌性腦膜炎、肌肉麻痹、病毒性心肌炎、手足口病、胰腺炎和糖尿病等，在我國均有報(bào)道［4］。

急性弛緩性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)是以消滅脊髓灰質(zhì)炎為目的而建立的一個(gè)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，而AFP病例的診斷要點(diǎn)為急性起病、肌張力減弱、肌力下降、腱反射減弱或消失。而其他HEV感染也可引起這些癥狀的出現(xiàn)，因此每年都可從AFP病例的糞便標(biāo)本中分離到大量的非脊灰腸道病毒，即可以利用AFP病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)作為一種便捷有效的腸道病毒監(jiān)測(cè)手段。

因病毒主要的免疫原性蛋白和中和抗原決定簇位點(diǎn)在VP1上，對(duì)VP1區(qū)的研究能夠用于腸道病毒分子分型和進(jìn)化分析［5，6］。本研究通過對(duì)四川省2007-2014年AFP病例中分離到的CVB5進(jìn)行VP1區(qū)基因序列分析和分子流行學(xué)特征分析，回顧性研究CVB5不同基因亞型的時(shí)間分布和地區(qū)分布，進(jìn)一步了解病毒的傳播動(dòng)態(tài)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 所用標(biāo)本來源于2007-2014年四川省AFP病例糞便標(biāo)本，由縣區(qū)級(jí)疾病預(yù)防控制中心采集，冷藏運(yùn)送至省級(jí)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷藏保存。

1.2病毒分離 所有糞便標(biāo)本均按照WHO《脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第四版方法用RD（人橫紋肌肉瘤細(xì)胞）、L20B（轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細(xì)胞）細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、病毒分離，病毒陽性分離物-80℃冷藏保存［7］。實(shí)驗(yàn)前接種RD細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖。

1.3病毒鑒定 采用微量中和試驗(yàn)法確定病毒型別（腸道病毒組合血清由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所脊灰實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.4RNA提取 采用Promega Maxwe11 16核酸自動(dòng)提取儀進(jìn)行病毒RNA提取。按照說明書從200 μ1的細(xì)胞培養(yǎng)物中提取50 μ1的病毒RNA，-80℃冷藏保存。

1.5VP1區(qū)RT-PCR及序列測(cè)定 RT-PCR反應(yīng)采用Invitrogen公司的Super Script III One-step RTPCR System試劑盒，使用引物490/492和491/493分段進(jìn)行全VP1區(qū)的核苷酸序列擴(kuò)增［6］。反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄45℃25 min，預(yù)變性94℃2 min，變性94℃15 s，退火48℃30 s，延伸65℃1.5 min，共40個(gè)循環(huán)，最后65℃5 min延伸。目的基因片段大小分別為700 bp和750 bp，在毛細(xì)管電泳上鑒定后用Wizard SV Ge1 and PCR C1eanup System（Promega）按廠家說明書進(jìn)行純化。純化PCR產(chǎn)物用相同引物分別進(jìn)行雙向標(biāo)記，標(biāo)記試劑為Bigdye Terminator v3.1 Cyc1e Sequencing Kit（App1ied Biosystems），反應(yīng)條件為：變性96℃ 10 s，退火50℃ 5 s，延伸60 ℃ 4 min，共 25個(gè)循環(huán)。標(biāo)記產(chǎn)物用 BigDye XTerminator Purification Kit（App1ied Biosystems）再次純化后，在 3500 XL Genetic Ana1yzer（App1ied Biosystems）上完成測(cè)序。

1.6序列分析 序列用Sequencher 5.0和Bioedit 7.0.9.0軟件編輯處理，使用NCBI中BLAST程序初步確定血清型，對(duì)所有毒株的全VP1序列進(jìn)行同源性分析，采用 Mega6.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析（Kimura 2參數(shù)模型，鄰位 -連接法，1000次bootstrap檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果

2.1病毒分離與鑒定 2007-2014年共采集的AFP病例糞便標(biāo)本2889份，分離到病毒陽性分離物313株，分離率為10.8%。所有毒株均已用腸道病毒組合血清和VP1區(qū)基因序列完成分型鑒定。其中腸道病毒A組8個(gè)型別，CVA4、CVA10、EV-A71這三個(gè)型別共占所有腸道病毒A組的78.38%；腸道病毒B組最多共24個(gè)型別，E14、E11、E6、CVB3、CVB5、E13較多；腸道病毒C組僅有2個(gè)型別，為CVA21和CVA24。在313株中，10株病毒陽性分離物被鑒定為CVB5，其中2007年分離到1株，分離率為0.03%（1/330）；2010年分離到1株，分離率為0.03%（1/338）；2014年分離到 8株，分離率為0.20%（8/396）；其余年份未分離到CVB5。所有序列均已上傳至 GenBank，登錄號(hào)為 LC120343～LC120352。CVB5相關(guān)病例的地區(qū)分布、麻痹時(shí)間、診斷結(jié)果見表1。

2.2同源性分析 本次分離到的10株CVB5的VP1區(qū)全長849 bp，編碼283個(gè)氨基酸，與原型株（Fau1kner）相比，無堿基的插入和缺失，在氨基酸序列上共有17個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，其中有8個(gè)位點(diǎn)是10株同時(shí)變異，另外9個(gè)位點(diǎn)有部分分離株發(fā)生變異。與原型株之間的核苷酸同源性為80.4% ～81.9%，氨基酸同源性為95% ～97.1%。這10株CVB5分離株之間的核苷酸同源性為 89.8% ～100%，氨基酸同源性為97.1% ～100%，其中14-1 和14-320VP1區(qū)核苷酸同源性和氨基酸同源性均為100%，而14-235和14-324的VP1區(qū)氨基酸序列完全一致。

表1　四川省CVB5分離株相關(guān)AFP病例的地區(qū)分布、麻痹時(shí)間和診斷結(jié)果Tab.1 Endemic distribution，time of para1ysis and c1inica1 diagnosis of CV5 re1ated AFP cases

2.3進(jìn)化樹分析 以CVB3原型株（Nancy株）和?？刹《?5型（Echovirus 15，E15）CH96—51株為外對(duì)照，將分離到的10株病毒與GenBank中檢索到的19條CVB5的VP1區(qū)核苷酸序列構(gòu)建親緣進(jìn)化樹，以此明確四川省CVB5分離株的遺傳進(jìn)化規(guī)律以及同國內(nèi)外CVB5分離株的親緣關(guān)系，見圖1。進(jìn)化樹分析表明，CVB5劃分為A、B、C、D 4個(gè)基因型。A基因型只包括原型株Fau1kner/AF114383株；B基因型主要為在歐美多個(gè)國家流行的毒株；C基因型包括我國山東省和韓國的兩株分離株Shandong/ CHN/GQ329771和KOR/AY875692，與他們同源性最近的還有3株豬水皰病毒（swine vesicu1ar disease viruses，SVDV）。10株四川省CVB5分離株均屬于D基因型。

3 討論

在CVB中，CVB5是引起人類疾病的最常見血清型。CVB5已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，且有較高的感染率，近年我國山東省、河南省、浙江省、云南省等均報(bào)道過由CVB5引起的無菌性腦膜炎暴發(fā)和散發(fā)［8-10］，福建省、安徽省也報(bào)道過從手足口病例中分離到CVB5［11，12］。本次研究的10例由CVB5感染引起的相關(guān)AFP病例中，5例診斷為格林巴列綜合征，4例診斷為肌炎，還有1例診斷為非脊灰腸道病毒感染?；仡櫺匝芯肯拗屏宋覀兊玫礁嗟呐R床相關(guān)信息，但仍然可以幫助我們確定CVB5能夠引起麻痹性疾病。

▲為CVB5四川分離株圖1　CVB5全VP1區(qū)序列進(jìn)化樹▲represents Sichuan iso1atesFig.1 Phy1ogenetic ana1ysis of VP1 region of CVB5

從2007-2014年四川省AFP病例標(biāo)本分離到的10株CVB5中，2014年一共分離到8株，占CVB5分離株的80%。鑒于AFP監(jiān)測(cè)沒有涵蓋CVB5可引起的所有病征，且由于腸道病毒為隱性感染，只有0.1%～1%的感染者會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，說明2014年四川省CVB5的感染者大約在800～8000例，提示2014年四川省腸道病毒的優(yōu)勢(shì)基因型可能變?yōu)镃VB5，并在四川省呈現(xiàn)流行狀態(tài)。而在2014年的8株分離株中，1株資陽分離株和1株成都分離株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致，成都市與資陽市相鄰；1株南充分離株和1株宜賓分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性均為100%，而南充市和宜賓市行政區(qū)域未接壤，說明CVB5不僅可以在相鄰區(qū)域傳播，還可以跨區(qū)域傳播。

本研究中的10株CVB5分離株在VP1區(qū)氨基酸序列上與原型株相比，在第7、75、90、91、125、132、268和273氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了變異，同法國、韓國以及我國浙江、山東、云南等地的分離株一致。而在第3位和第80位上，有4株的氨基酸從P和K變?yōu)門和R；在第19位和第54位，有1株由G和K分別變?yōu)镋和R；在第95位，7株分離株的氨基酸從N變異為S；第200位有5株從R變?yōu)镵；在244位，有1株由V變?yōu)镮；在第259和第278位，有1株由K和T變異為M和I。關(guān)于病毒序列變異與病毒毒力和臨床致病性的關(guān)系是近年臨床和分子生物工作者努力研究的課題，但本研究中CVB5的VP1氨基酸變異與臨床表現(xiàn)的確切關(guān)系不明，可能與以下因素有關(guān)：首先VP1蛋白是EV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，關(guān)鍵部位氨基酸的變化可能會(huì)引起病毒空間結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致病毒毒力變化；其次VP1序列變異對(duì)感染機(jī)體的某些免疫活性細(xì)胞和活性分子的調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生影響；最后本研究是從AFP病例中得到的分離株，由于CVB5能夠引起的疾病種類較多，這些氨基酸位點(diǎn)的變化會(huì)否引起其他疾病臨床表現(xiàn)不同還需要進(jìn)一步研究。

VP1區(qū)核苷酸序列親緣進(jìn)化樹顯示CVB5在地理和時(shí)間分布上有一定的聚集性，A基因型僅有1950年分離的原型株Fau1kner株；B基因型主要為1985-2002年在歐美多個(gè)國家流行的毒株；C基因型于20世紀(jì)70年代中期至20世紀(jì)末在亞洲流行，與他們同源性最近的SVDV在抗原性上與CVB5相似，一般只在豬中間流行，不引起人類發(fā)病；D基因型是目前在世界范圍內(nèi)流行的基因型，包括芬蘭、法國、韓國等均分離到 D基因型［13，14］，我國山東、浙江、云南、河南等地的分離株也為D基因型。本次分離到的10株CVB5四川分離株均屬于D基因型，與我國及世界流行情況相符。且這10株分離株親緣關(guān)系都較近，說明四川省CVB5遺傳特性較為穩(wěn)定。而07年瀘州分離株和10年瀘州分離株親緣關(guān)系很近，說明CVB5在瀘州地區(qū)從2007年到2010年可能發(fā)生持續(xù)流行且遺傳特性穩(wěn)定。

本研究利用AFP病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)CVB5進(jìn)行

監(jiān)測(cè)，了解其基因特征和流行情況，有助于CVB5相關(guān)疾病的預(yù)防和控制。

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Genetic characteristics of Coxsackie virus B5 isolates in Sichuan province over 2007-2014

MaXiaozhen，Tong Wenbin，Liu Li，Cao Ranran，Chen Na Sichuan Center for Disease Control and Prevention，Chengdu 610041，China

Chen Na，Email：emmanana@163.com

Objective To investigate genetic characteristics of Coxsackie virus B5（CVB5）in acute f1accid para1ysis（AFP）cases in Sichuan Province.Methods 10 CVB5 strains iso1ated from stoo1 samp1es of AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were subjected to entire VP1 coding region amp1ification by reverse transcription-po1ymerase chain reaction（RT-PCR）and nuc1eotide sequencing，and phy1ogenetic tree was constructed for genetic characterization.Results A11 of the 10 strains were identified as genogroup D.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies were 80.4%-81.9%and 95%-97.1%，which compared with the Fau1kner prototype strain.The amino acid homo1ogies between Ziyang strain and Chengdu strain obtained in 2014 were 100%，respective1y.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies between Nanchong iso1ate and Yibin iso1ate obtained in 2014 were both 100%，respective1y.Conclusions The iso1ates from AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were be1ong to genogroup D.The genetic characteristics of 10 strains were stab1e.

Acute f1accid para1ysis；Coxsackie virus B5；Genetic characteristics ana1ysis

陳娜，Emai1：emmanana@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.012

2015-12-23）