崔雨 王穎 甘星 宋娟 韓俊

450000鄭州人民醫(yī)院（崔雨）；261000濰坊醫(yī)學(xué)院（王穎）；430000武漢醫(yī)療救治中心（甘星）；102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室（宋娟、韓?。┐抻?，王穎為并列第一作者

EV71 IgM抗體均相酶聯(lián)免疫檢測方法的初步建立

崔雨 王穎 甘星 宋娟 韓俊

450000鄭州人民醫(yī)院（崔雨）；261000濰坊醫(yī)學(xué)院（王穎）；430000武漢醫(yī)療救治中心（甘星）；102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室（宋娟、韓?。?br/>崔雨，王穎為并列第一作者

目的 建立一種快速檢測腸道病毒71型（EV71）IgM抗體的均相ELISA新技術(shù)。方法 首先克隆表達純化EV71 VP1蛋白，使用生物素標(biāo)記該蛋白。通過ELISA法摸索出Bio-EV71 VP1的最適抗原量為0.0375 μg。優(yōu)化供體微球、受體微球、血清等實驗反應(yīng)體系，建立EV71 VP1的均相酶聯(lián)免疫檢測方法的IgM檢測技術(shù)。使用EV71感染的手足口?。℉FMD）患者和健康人血清進行均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測評價，并與ELISA檢測結(jié)果相比較。結(jié)果 獲得EV71 VP1純化蛋白并生物素化。摸索出均相酶聯(lián)免疫檢測方法的體系：5 μg/m1受體微球、0.037 5 μg生物素化的VP1、20 μg/m1供體微球、血清2 μ1，總體系為20 μ1。采用ELISA和均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測方法對樣本血清進行IgM檢測。兩種方法同時檢出手足口病患者1gM陽性16份；14份ELISA法檢出陰性樣本中，均相酶聯(lián)免疫檢測方法法檢出陽性6份。20份健康人血清，2種方法檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論 本研究初步建立了EV71 VP1 IgM的均相酶聯(lián)免疫檢測方法。

【主題詞】 EV71；VP1；IgM；均相酶聯(lián)免疫檢測方法基金項目：傳染病重大專項（2013ZX10004-001）

Fund program：China Mega-Project for Infectious Disease（2013ZX10004-001）

手足口病是我國嬰幼兒常見的疾病，以發(fā)熱和手、足、口腔、臀部等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹等為主要臨床表現(xiàn)，少數(shù)患兒可引起無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹及腦炎等并發(fā)癥，甚至出現(xiàn)死亡［1，2］。而腸道病毒71型（EV71）是引起重癥病例的主要原因。研究表明，EV71衣殼蛋白VP1表面的峽谷樣結(jié)構(gòu)是受體分子的結(jié)合位點［3，4］。目前，針對EV71病毒血清IgM的檢測方法耗時較長，且受多種因素干擾［5］。而均相ELISA技術(shù)是一種基于微球偶聯(lián)發(fā)光物質(zhì)的新型均相檢測技術(shù)，由于抗原抗體相互作用使得供受體微球之間的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)而產(chǎn)生放大信號。均相酶聯(lián)免疫檢測方法利用長波長680 nm激發(fā)，短波長615 nm發(fā)射，避開了來自組織中熒光的背景，避免了血清樣本中因為溶血而引起的干擾。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測方法比較，均相酶聯(lián)免疫檢測方法具有敏感性高、檢測背景低、不要洗滌步驟等特點，可以檢測組織、全血等樣本中的抗體、抗原和物質(zhì)［6］。因此，本研究擬建立 HFMD血清的 EV71 IgM均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測方法。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌種及生化試劑 pET-30a（+）質(zhì)粒、BL21（DE3）感受態(tài)細胞為本實驗室保存，EV71 VP1基因從病人標(biāo)本中提取RNA后經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄而來，相關(guān)試劑購自美國 Invitrogen。針對 EV71 VP1的單克隆抗體anti-EV71 VP1（ab36367）購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗鼠二抗購自美國Santa-Cruz公司。生物素化試劑盒（Biotin 1abe1ing kit）購自日本同仁化學(xué)研究所。均相酶聯(lián)免疫檢測方法受體與供體微球購自美國PerkinE1mer公司。EV71-IgM ELISA檢測試劑盒購自萬泰公司。

1.2全長EV71 VP1蛋白的表達純化及鑒定 根據(jù)報道序列（GenBank：HM579945.1）設(shè)計、合成EV71 VP1全基因引物，上游5′-CATATG GGA GAT AGG GTG GCA GAT GT-3′，下游5′-CTCGAG GTA AAG AGT GGT GAT CGC TGT GC-3′，同時分別在上、下游引物的5'端加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。將所得PCR產(chǎn)物連接至pET30a表達載體。常規(guī)誘導(dǎo)表達蛋白后，利用鎳離子親和層析柱進行蛋白純化。將純化后的EV71 VP1蛋白以anti-EV71 VP1單抗為一抗進行Western B1ot鑒定。

1.3EV71 VP1蛋白的生物素化及最適濃度的確定 生物素化過程按照說明書進行操作。為評價VP1抗原的生物素化效果，將EV71 VP1抗體按照1∶2 000稀釋包被酶標(biāo)板4℃過夜。加入以1 μg為起始濃度倍比稀釋生物素化抗原。孵育1 h，洗滌，加入1∶1 000 HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，顯色15 min，檢測吸光度。

1.4EV71-lgM均相酶聯(lián)免疫檢測反應(yīng)體系 選擇經(jīng)ELISA方法證明EV71 IgM陽性樣本3份和陰性樣本2份，確定均相酶聯(lián)免疫檢測體系。以受體微球10 μg/m1、供體微球40 μg/m1、血清量5 μ1和生物素化VP1蛋白量為0.0375 μg，總體系為50 μ1，以檢測值/對值≥2.1作為陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。體系穩(wěn)定后優(yōu)化實驗條件：供體微球濃度從40 μg/ m1至20 μg/m1進行調(diào)整，受體微球從10 μg/m1至5 μg/m1濃度調(diào)整范圍，樣本量在1～5 μ1之間調(diào)整。

1.5均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測EV71 IgM方法的建立 收集30例HFMD患兒的血清樣本（發(fā)病后1～9 d采集）和20例健康兒童的血清樣本作為對照。使用 ELISA方法檢測樣本確定血清中的IgM。根據(jù)優(yōu)化的均相酶聯(lián)免疫檢測方法反應(yīng)體系檢測上述樣本，依次加入2 μ1的血清樣本、8 μ1的2.5×抗μ鏈?zhǔn)荏w微球、生物素化的抗原0.0375 μg的混合物至384微孔板中，室溫孵育1 h。再加入10 μ1的2×偶聯(lián)有鏈霉親和素的供體微球，室溫避光孵育30 min。使用Enspire-A1pha檢測儀檢測，檢測值是陰性對照值的2.1倍判斷為陽性。與ELISA檢測方法比較來評價均相酶聯(lián)免疫檢測方法的有效性。

2 結(jié)果

2.1重組EV71 VP1的表達純化與鑒定 PCR產(chǎn)物片段大小約891 bp，與預(yù)期VP1全基因序列長度一致；經(jīng)常規(guī)鎳離子交換誘導(dǎo) Western B1ot結(jié)果顯示0.1 μg和0.05 μg的蛋白可被特異性單抗識別，呈現(xiàn)出明顯的反應(yīng)條帶，與預(yù)期蛋白相對分子質(zhì)量大小一致，約為34 kD。結(jié)果顯示成功表達純化出EV71 VP1蛋白（圖1）。

2.2生物素標(biāo)記的VPl蛋白最適濃度確定 按照均相酶聯(lián)免疫檢測方法的要求，我們將純化的VP1蛋白進行生物素標(biāo)記，通過生物素標(biāo)記后VP1蛋白濃度約為0.8 mg/m1。通過ELISA鑒定，生物素標(biāo)記的VP1蛋白顯示良好的特異性反應(yīng)。以檢測孔OD值/對照孔OD值比≥2.1為陽性確定指標(biāo)，結(jié)果顯示大于0.0375 μg的標(biāo)記蛋白檢測與對照孔的比值均≥2.1。

圖1　EV71 VP1蛋白的Western B1ot鑒定1.His-GST protein as a contro1.2.EV71 0.05 μg VP1 protein；3.0.1 μg VP1 protein Protein marker was showed in the 1eftFig.1 EV71 VP1 was identified by Western B1ot

2.3均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測體系建立 經(jīng)反復(fù)試驗后得到一個穩(wěn)定的檢測體系：5 μg/m1受體微球、0.0375 μg生物素化的VP1、20 μg/m1供體微球、血清2 μ1，總體系為20 μ1。

2.4均相酶聯(lián)免疫檢測方法的應(yīng)用及方法評價通過ELISA檢測顯示30例手足口病樣本中EV71 IgM陽性樣本16例，20例健康兒童血清樣本全部為陰性。優(yōu)化的均相酶聯(lián)免疫檢測，顯示16例患兒血清1gM陽性樣本，均相酶聯(lián)免疫檢測也均顯示為陽性。均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測20份正常人血清樣本，結(jié)果顯示均為陰性。然而，14份ELISA檢測結(jié)果為陰性的手足口病患者的血清樣本，經(jīng)均相酶聯(lián)免疫檢測方法檢測出現(xiàn)6份陽性結(jié)果（表1）。

3 討論

腸道病毒71型感染可引起手足口病重癥病例。重癥病例可因合并腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫、呼吸循環(huán)衰竭而危及患兒生命或留有后遺癥。因此，手足口病患者及時診斷是否為EV71感染顯得尤為重要。然而，現(xiàn)有EV71感染手足口病血清IgM抗體診斷方法存在一些缺點，如檢測步驟繁瑣、反復(fù)洗滌等。由于酶結(jié)合檢測，組織中尤其血清中因溶血而引起免疫球蛋白、血紅蛋白、風(fēng)濕因子對檢測結(jié)果的判斷影響非常大。因此，建立一種低背景的均相EV71血清IgM實驗室診斷技術(shù)具有非常重要的作用。

我們初步建立了EV71 IgM的均相酶聯(lián)免疫檢測方法。該方法檢測血清的樣本量僅為2 μ1，而且該方法整個過程無需洗滌，與相應(yīng)的檢測儀器配合，可達到檢測速度快、通量高、背景低的特點。通過臨床樣本進一步驗證了EV71 IgM的均相酶聯(lián)免疫檢測方法，結(jié)果顯示具有很好的特異性，然而，在ELISA檢測陰性樣本檢出了陽性結(jié)果，我們分析可能存在兩種原因，可能ELISA方法的敏感性較差，難以檢出部分EV71感染患者血清中的IgM；也可能建立的均相酶聯(lián)免疫檢測方法的特異性不夠。因此，我們建立的EV71IgM均相酶聯(lián)免疫檢測方法還需要更大量的樣本來進一步驗證和評價。

表1　均相酶聯(lián)免疫檢測方法與ELISA法檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison between homogeneous enzyme immunosorbent assay and ELISA

［1］ Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et a1.Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71：high incidence of comp1ication disorders of centra1 nervous system.Arch Dis Chi1d，1980，55：583-8.doi：10.1136/adc.55.8.583.

［2］ Me1nick JL.Enterovirus type 71 infections：a varied c1inica1 pattern sometimes mimicking para1ytic po1iomye1itis.Rev Infect Dis，1984，6：S387-90.doi：10.1093/c1inids/6.Supp1ement_ 2.S387.

［3］ Shih SR，Li YS，Chiou CC，et a1.Expression of capsid protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection.J Med Viro1，2000，61：228-34.doi：10.1002/（SICI）1096-9071（200006）61：2＜228：：AID-JMV9＞3.0CO；2-R.

［4］ Yu CK，Chen CC，Chen CL，et a1.Neutra1izing antibody provided protection against enterovirus type 71 1etha1 cha11enges in neonata1 mice.J Biomed Sci，2000，7：523-8.doi：10.1007/ BF02253368.

［5］ 王穎.EV 71 A1phaLISA檢測EV71 IgM方法的建立.安徽理工大學(xué)，2011，doi：10.7666/d.y1976328.

［6］ Bie1efe1d-Sevigny M.A1phaLISA immunoassay p1atform-the“nowash”high-throughput a1ternative to ELISA.Assay Drug Dev Techno1，2009，7：90-92.doi：10.1089/adt.2009.9996.

Primary establishment of a homogeneous enzyme immunosorbent assay for EV71 IgM of HFMD serum

Cui Yu，Wang Ying，Gan Xing，Song Juan，Han JunPeople′s Hospital of Zhengzhou，Henan 450000，China（Cui Y）.WeiFang Medical University，Shandong 261000 China（Wang Y）.Wuhan Medical Treatment Center，Hubei，430000，China（Gan X）.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control.National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Song J，Han J）. Cui Yu and Wang Ying are the first authors who contributed equally to the article

Han Jun，Email：hanjun_sci@163.com；Song Juan，Email：helen831020@126.com

Objective To deve1op new homogeneous enzyme immunosorbent assay for serum IgM antibody of EV71 infection.Methods After protein EV71 VP1 1-297 was purified and biotiny1ated，the optima1 quantities of the antigen was obtained by ELISA.The homogeneous enzyme immunosorbent assay was va1uated with the serum samp1es of both 20 hea1thy subjects and 30 samp1es from the patients of HFMD detected by ELISA.Results The reaction system of homogeneous enzyme immunosorbent assay for EV71 IgM was estab1ished in this study.Then the homogeneous enzyme immunosorbent assay was va1uated with ELISA for EV71 IgM.The resu1ts revea1ed serum IgM were negative for the 20 hea1thy subjects by both ELISA and homogeneous enzyme immunosorbent assay.Of the 30 HFMD patients，positive serum EV71 IgM detected by both ELISA and homogeneous enzyme immunosorbent assay，and yet，6 IgM positive samp1es were identified with homogeneous enzyme immunosorbent assay in the 14 negative samp1es detected by ELISA.Conclusion A homogeneous enzyme immunosorbent assay for detection of serum EV71 IgM has been estab1ished.

EV71；VP1；IgM；homogeneous ELISA

韓俊，Emai1：hanjun_sci@163.com；宋娟，Emai1：he1en831020@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.027

2016-03-03）