陳占偉　孫杜斌　黃圣運　吳海威　張東升

1.山東大學附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科，濟南 250021；2.鄒城市人民醫(yī)院口腔科，濟寧 273500

涎腺腺樣囊性癌中BNIP3蛋白的表達及臨床意義分析

陳占偉1孫杜斌2黃圣運1吳海威1張東升1

1.山東大學附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科，濟南 250021；2.鄒城市人民醫(yī)院口腔科，濟寧 273500

目的研究促凋亡蛋白BNIP3在涎腺腺樣囊性癌（SACC）中的表達以及與臨床病理特征及患者預后的關系，探討其在腺樣囊性癌低氧自噬中的作用。方法采用免疫組織化學法檢測65例SACC患者中BNIP3、低氧誘導因子（HIF）-1α和LC3的蛋白表達，分析BNIP3表達與SACC臨床病理特征之間的關系及其與HIF-1α、LC3表達的相關性，并對患者生存率進行單因素生存分析。結果BNIP3在41例SACC中陽性表達（63.1%），其表達的高低與組織學分級相關（P=0.001）。BNIP3與HIF-1α的表達相關（P=0.011），與LC3的表達無明顯相關性（P=0.167）。BNIP3陰性表達組的總體存活率高于BNIP3陽性表達組（P＜0.05）。結論BNIP3在SACC的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，為SACC的基因靶向治療提供了新的治療方向。

腺樣囊性癌；BNIP3蛋白；低氧；低氧誘導因子；自噬

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carci-noma，SACC）是惡性唾液腺腫瘤中的常見類型，約占所有唾液腺腫瘤的10%，占所有惡性唾液腺腫瘤中的22%［1］?，F(xiàn)階段對于腺樣囊性癌的治療方案主要是以根治手術為主，同時輔以放療的綜合序列治療，但腺樣囊性癌的總體療效仍不能讓人滿意。

低氧作為實體腫瘤微環(huán)境中常見的現(xiàn)象，對于腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及血管生成有重要的作用。低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1是在低氧條件下重要的轉錄因子，其中HIF-1α是HIF-1的功能亞基，已經(jīng)在多數(shù)癌癥中觀察到，并與不良預后及治療抵抗相關［2-3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在涎腺腺樣囊性癌中廣泛表達，而在腫瘤附近正常涎腺腺體組織中鮮有表達。BNIP3，即Bcl2/腺病毒E1B相對分子質量為19×103的相關蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19×103interacting protein 3），屬于促凋亡蛋白，其表達受HIF-1α依賴的缺氧的調(diào)節(jié)及其他很多因素的影響。BNIP3蛋白主要定位于線粒體外膜，當其被激活后，完全整合入線粒體外膜，通過開放線粒體通透性轉運孔損傷線粒體功能引起染色質凝聚、DNA分解，最終導致細胞凋亡。BNIP3的異常表達和很多腫瘤的進展、化療耐藥及自噬密切相關。BNIP3的表達受到轉錄因子HIF-1α的調(diào)控，在低氧誘導細胞自噬凋亡過程中起重要的作用。然而，涎腺腺樣囊性癌中BNIP3蛋白的表達及其調(diào)節(jié)的低氧誘導自噬通路和臨床病理學行為尚未有報道。本實驗通過對腺樣囊性癌組織和細胞中BNIP3以及低氧相關蛋白HIF-1α和自噬相關蛋白LC3的檢測，探索其在腺樣囊性癌低氧自噬中的作用，同時分析BNIP3的表達在腺樣囊性癌研究中的臨床意義，為腺樣囊性癌的基因靶向治療尋找新的治療方向。

1　材料和方法

1.1研究對象

對2002—2011年期間于山東大學附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科進行腫瘤切除手術的65例涎腺腺樣囊性癌病例（所有病例術前均未進行放射治療或者化療）進行整理回顧，所選病理標本均由山東大學附屬山東省立醫(yī)院病理科病理證實為腺樣囊性癌，所有患者臨床病理資料及術后隨訪資料完整。65例患者中，女性26例，男性39例，平均年齡48.2歲（18～75歲）。腫瘤平均大小1.9 cm（0.6～4.5 cm）。根據(jù)美國聯(lián)合癌癥分類委員會制定的最新腫瘤分期標準對腫瘤進行臨床TNM分期。組織學分級為:Ⅰ級，腫瘤中主要為管狀型和（或）篩孔型兩種病理類型，無實體型存在；Ⅱ級，腫瘤中存在管狀型和（或）篩孔型，但實體型成分小于等于30%；Ⅲ級，腫瘤中管狀型和篩孔型較少見，以實體型為主［4］。

1.2免疫組織化學染色檢測腺樣囊性癌中BNIP3、HIF-1α和LC3的蛋白表達

采用免疫組織化學EnvisionTM二步法，操作步驟按說明書進行，一抗為鼠抗人BNIP3單克隆抗體（1∶100，Santa Cruz公司，美國）、兔抗人LC3A/ B多克隆抗體（1∶200，Abcam公司，英國）、兔抗人HIF-1α多克隆抗體（1∶50，武漢博士德生物工程有限公司），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）。4 μm厚白片經(jīng)脫蠟水化后，其中BNIP3、LC3應用枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、HIF-1α應用EDTA（pH 9.0）高壓水浴加熱，進行抗原修復20 min，室溫冷卻后，滴加3%過氧化氫溫箱孵育30 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜；次日提前1 h取出復溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3 次；DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精襯染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。用PBS取代一抗作為空白對照。

判斷標準:BNIP3的表達一般定位于胞漿內(nèi)，而HIF-1α和LC3可同時表達于細胞胞漿或者細胞核內(nèi)，本實驗僅評價細胞核內(nèi)HIF-1α的表達以及細胞漿內(nèi)LC3的表達。參考現(xiàn)有免疫評價標準，根據(jù)整個切片中陽性的強度和面積對每例病例進行評分，陽性強度分為無（0分）、弱（1分）、中（2分）、強（3分）4個級別，陽性面積分為＜10%（0分）、10%～49%（1分）、≥50%（2分）。對于HIF-1α的評估，由于其核染色的特殊性，將陽性表達率小于30%視為陰性表達，陽性表達率大于等于30%視為陽性表達。結果評判由2名醫(yī)師進行雙盲讀片確定。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用Pearson χ2檢驗或連續(xù)矯正的χ2檢驗對SACC組織中BNIP3表達與患者的臨床病理特征參數(shù)之間的關系進行比較，對BNIP3與HIF-1α、LC3表達的相關性進行分析。采用Kaplan-Meier法對患者生存率進行單因素生存分析，差異顯著性采用Log-Rank檢驗。

2　結果

2.1BNIP3在腺樣囊性癌中的表達以及與臨床病理特征的關系

BNIP3在正常唾液腺細胞中呈陰性表達，而在SACC 3種不同的組織病理類型（篩孔、管狀和實體型）中均可觀察到BNIP3的陽性表達（圖1）。BNIP3 在65例腺樣囊性癌中有41例陽性表達（63.1%），其表達的高低與組織學分級相關（P=0.001），而與年齡、性別、TNM分期、腫瘤大小和遠處轉移無明顯相關性（表1）。

圖1　BNIP3的表達　免疫組織化學染色　× 200Fig　1　The expression of BNIP3　immunohistochemical staining　× 200

表1　BNIP3與腺樣囊性癌臨床病理特征之間的關系Tab　1　Correlation between BNIP3 expression and the clinicopathologic variables in SACC

2.2BNIP3與HIF-1α、LC3表達的相關性

BNIP3與HIF-1α、LC3的表達相關性見表2、3。BNIP3與HIF-1α的表達相關（P=0.011），與LC3的表達無明顯相關性（P=0.167）。

表2　BNIP3與HIF-1α的表達相關性Tab　2　Correlation between BNIP3 and HIF-1α expression in SACC

2.3生存率分析

65例患者平均隨訪時間為63個月（18～115個月），30例患者死于本病，33例患者仍然存活，2例失訪。Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗結果表明，BNIP3陰性表達組的總體存活率高于BNIP3陽性表達組（P＜0.05）（圖2）。

表3　BNIP與LC3的表達相關性Tab　3　Correlation between BNIP3 and LC3 expression in SACC

圖2　Kaplan-Meier法分析BNIP3陰性與陽性表達組腺樣囊性癌患者的生存率曲線Fig　2　Kaplan-Meier survival estimate for cumulative survival rate of patients with SACC according to BNIP3 negative and positive expression

3　討論

BNIP3是Bcl-2家族的促凋亡成員，可以與其他Bcl-2家族促凋亡成員相互作用。BNIP3含有多個結構功能域，其中發(fā)揮重要功能作用的就是BH3域，BNIP3可以通過BH3域與其他蛋白發(fā)生交互作用。BNIP3已經(jīng)被證實是低氧狀態(tài)細胞應對外界壓力的重要作用基因。BNIP3的啟動子含有一個缺氧反應元件，而該結構是HIF-1轉錄調(diào)節(jié)的重要靶點，因此BNIP3被視為HIF-1α調(diào)節(jié)的重要下游基因。目前關于BNIP3是原癌基因還是抑癌基因的爭論很多。研究表明，BNIP3在胰腺癌［5］、結腸直腸癌和胃癌［6］、造血惡性腫瘤［7］中低表達而在非小細胞肺癌［8］、基底細胞癌［9］、膽管癌［10］中高表達。學者［11］指出，BNIP3可在乳腺癌誘發(fā)進展過程中的不同階段發(fā)揮完全相反的作用。雖然在人體多種惡性腫瘤中均有研究，但是對于BNIP3在涎腺腺樣囊性癌中的角色認識仍然十分有限。

本實驗證實，BNIP3在正常唾液腺組織中呈陰性表達，而在SACC 3種不同病理類型中呈陽性表達，且與組織病理學分級相關。組織學Ⅲ級、細胞分化差的腫瘤組織中，BNIP3的表達顯著高于細胞分化較好的組織學Ⅰ級和Ⅱ級。另外，BNIP3陰性表達組的總體存活率比BNIP3陽性表達組更高。這一特點與腫瘤的惡性程度一致，提示BNIP3在腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。

本實驗同時也探究了HIF-1α與LC3在腺樣囊性癌中的表達，結果發(fā)現(xiàn)在腺樣囊性癌細胞中HIF-1α/ BNIP3通路調(diào)節(jié)的低氧自噬可能在腺樣囊性癌中發(fā)揮著重要作用。本課題前期體外實驗中通過模擬低氧狀態(tài)刺激腺樣囊性癌細胞發(fā)現(xiàn)，細胞中HIF-1α/ BNIP3通路活性明顯上調(diào)，并且細胞自噬水平也明顯提高，這表明BNIP3可能在腺樣囊性癌的低氧自噬中有重要作用。然而，本實驗中發(fā)現(xiàn)BNIP3的表達與LC3的表達并不相關。事實上，本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導自噬的通路十分復雜，不同缺氧調(diào)節(jié)下調(diào)節(jié)低氧自噬的信號通路也不相同，一般來說當細胞處于極度缺氧條件下，除上述依賴HIF-1α/BNIP3信號通路調(diào)節(jié)活化的低氧自噬外，非HIF-1α依賴的低氧自噬通路也起著十分關鍵的作用。通過對極度低氧狀態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，在極度低氧甚至乏氧狀態(tài)下AMPK信號通路和UPR信號通路的活化可以誘導自噬的發(fā)生［12］。因此，筆者推測在腺樣囊性癌組織中的不同部位低氧環(huán)境不同從而導致不同的信號通路活化，這也就解釋了為什么在腺樣囊性癌組織中BNIP3和LC3表達不相關的原因。

綜上所述，BNIP3可能在涎腺腺樣囊性癌的誘發(fā)進展過程中扮演重要的角色，而且BNIP3可能成為腺樣囊性癌的一個新的預后因子，作為一種新的腺樣囊性癌腫瘤標記物在未來的生物治療中起到重要作用。

［1］ Bradley PJ. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck: a review［J］. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg， 2004，12（2）:127-132.

［2］ 韓波， 李龍江， 代煒. 低氧誘導因子-1α在原發(fā)性頰黏膜鱗癌中的表達及意義［J］. 華西口腔醫(yī)學雜志， 2007， 25（1）: 5-7. Han B， Li LJ， Dai W. Expression and significance of hypoxia inducible factor-1alpha in buccal carcinoma［J］. West Chin J Stomatol， 2007， 25（1）:5-7.

［3］ Birner P， Schindl M， Obermair A， et al. Expression of hypoxiainducible factor 1alpha in epithelial ovarian tumors: its impact on prognosis and on response to chemotherapy［J］. Clin Cancer Res， 2001， 7（6）:1661-1668.

［4］ Szanto PA， Luna MA， Tortoledo ME， et al. Histologic grading of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands［J］. Cancer，1984， 54（6）:1062-1069.

［5］ Okami J， Simeone DM， Logsdon CD. Silencing of the hypoxia-inducible cell death protein BNIP3 in pancreatic cancer［J］. Cancer Res， 2004， 64（15）:5338-5346.

［6］ Murai M， Toyota M， Suzuki H， et al. Aberrant methylation and silencing of the BNIP3 gene in colorectal and gastric cancer［J］. Clin Cancer Res， 2005， 11（3）:1021-1027.

［7］ Murai M， Toyota M， Satoh A， et al. Aberrant DNA methylation associated with silencing BNIP3 gene expression in haematopoietic tumours［J］. Br J Cancer， 2005， 92（6）:1165-1172.

［8］ Giatromanolaki A， Koukourakis MI， Sowter HM， et al. BNIP3 expression is linked with hypoxia-regulated protein expression and with poor prognosis in non-small cell lung cancer ［J］. Clin Cancer Res， 2004， 10（16）:5566-5571.

［9］ Brinkhuizen T， Weijzen CA， Eben J， et al. Immunohistochemical analysis of the mechanistic target of rapamycin and hypoxia signalling pathways in basal cell carcinoma and trichoepithelioma［J］. PLoS ONE， 2014， 9（9）:e106427.

［10］ Thongchot S， Yongvanit P， Loilome W， et al. High expression of HIF-1α， BNIP3 and PI3KC3: hypoxia-induced autophagy predicts cholangiocarcinoma survival and metastasis ［J］. Asian Pac J Cancer Prev， 2014， 15（14）:5873-5878.

［11］ Tan EY， Campo L， Han C， et al. BNIP3 as a progression marker in primary human breast cancer； opposing functions in in situ versus invasive cancer［J］. Clin Cancer Res， 2007，13（2 Pt 1）:467-474.

［12］ Healy SJ， Gorman AM， Mousavi-Shafaei P， et al. Targeting the endoplasmic reticulum-stress response as an anticancer strategy［J］. Eur J Pharmacol， 2009， 625（1/2/3）:234-246.

（本文編輯李彩）

Analysis of BNIP3 expression and clinical research in salivary adenoid cystic carcinoma

Chen Zhanwei1， Sun Dubin2，Huang Shengyun1， Wu Haiwei1， Zhang Dongsheng1.（1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China； 2. Dept. of Stomatology， The People's Hospital of Zoucheng City， Jining 273500， China）
Supported by: The Natural Science Foundation of Shandong Province （ZR2012HQ022）. Correspondence: Zhang Dongsheng，E-mail: ds63zhang@163.com.

ObjectiveThis study investigated the expression of BNIP3 in salivary adenoid cystic carcinoma （SACC） and its correlations to the clinicopathological features and prognosis of patients with SACC. The role of BNIP3 in the progress of hypoxia-induced autophagy was elucidated. MethodsThe expression levels of BNIP3， hypoxia inducible factor （HIF）-1α，and LC3 in 65 SACC cases were detected by immunohistochemical staining method， and the correlation between the expression of BNIP3 and the clinicopathological features in SACC was analyzed. In addition， the correlations of BNIP3 gene expression with HIF-1α and LC3 gene expression were analyzed. The survival rate of patients with SACC was evaluated by univariate survival analysis. ResultsBNIP3 was considerably expressed in SACC in all three histological patterns， and was positive in 41 cases （63.1%）. BNIP3 gene expression was significantly correlated with histological grade （P=0.001） and HIF-1α gene expression （P=0.011）. By contrast， BNIP3 gene expression was not significantly correlated with LC3 gene expression （P= 0.167）. The overall survival rate of patients with negative BNIP3 expression was better than that of patients with positive BNIP3 expression （P＜0.05）. ConclusionBNIP3 might play a vital role in the tumorigenesis of SACC and may be a new target for gene therapy.

adenoid cystic carcinoma；BNIP3；hypoxia；hypoxia inducible factor；autophagy

R 739.81

A

10.7518/hxkq.2016.04.017

2015-11-16；

2016-01-18

山東省自然科學基金（ZR2012HQ022）

陳占偉，主治醫(yī)師，博士，E-mail:chzhanwei@126.com

張東升，教授，博士，E-mail:ds63zhang@163.com