楊若明，楊　林，田字彬，于亞男，毛　濤，李曉宇，張帥慶

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Helicobacter suis感染小鼠模型的建立及其意義

楊若明，楊林，田字彬，于亞男，毛濤，李曉宇，張帥慶

目的建立Helicobactersuis(H.suis)感染小鼠模型并探究其意義。方法將40只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，模型組給予0.5 mL豬胃黏膜勻漿液(經(jīng)PCR檢測(cè)確定存在H.suis)灌胃，對(duì)照組給予0.5 mL PBS溶液灌胃。灌胃1個(gè)月及3個(gè)月后，各處死兩組中半數(shù)小鼠，取其胃黏膜組織，分別行PCR、HE染色檢測(cè)H.suis在小鼠胃內(nèi)的定植與胃黏膜淋巴濾泡形成情況。結(jié)果灌胃所用豬胃黏膜勻漿液中存在H.suis；H.suis可以在小鼠胃內(nèi)定植，并且3個(gè)月后仍存在；感染H.suis1個(gè)月及3個(gè)月后的小鼠胃黏膜均有淋巴濾泡的形成，并且后者的淋巴濾泡較前者明顯增大。結(jié)論成功建立了H.suis感染C57BL/6小鼠模型，H.suis可以誘導(dǎo)胃黏膜淋巴濾泡的形成，可能在胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

H.suis；豬胃；動(dòng)物模型；淋巴濾泡

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海爾曼螺桿菌(Helicobacterheilmannii,Hh)是除幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)外最常見(jiàn)的定植于人類胃黏膜的螺旋桿菌，通過(guò)16Sr RNA基因序列分析可將其分為兩型[1]：其中感染人類的大部分為1型(約占78.5%)，為單獨(dú)的菌種，與豬胃黏膜中分離得到的豬螺桿菌(Helicobactersuis，H.suis)有高度的同源性，可視為同一菌種[2]；2型代表了定植于貓與犬胃內(nèi)的一組細(xì)菌，包括H.felis,H.bizzozeronii,H.salomonis,H.cynogastricus,H.baculiformis和H.heilmanniisp.nov等。H.suis能自然定植于人和諸多動(dòng)物胃內(nèi)并具有致病性，為人獸共患病病原菌。國(guó)外研究已發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于食蟹猴胃內(nèi)的H.suis可穩(wěn)定定植于小鼠胃內(nèi)，感染6個(gè)月后可使絕大多數(shù)小鼠胃中出現(xiàn)MALT淋巴瘤特征性的淋巴上皮病變(lymphoepithelial lesion, LEL)[3]。因此H.suis可作為H.pylori研究的替代工具，用于闡明螺桿菌與特異宿主之間的相互作用關(guān)系，為研究胃MALT淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)重要途徑。由于H.suis在豬胃中的自然感染率較高(可達(dá)60%以上)[2,4]，且該菌在體外生長(zhǎng)環(huán)境特殊，營(yíng)養(yǎng)要求高，難以穩(wěn)定培養(yǎng)，因此本研究擬從自然感染的豬胃中獲得H.suis并感染小鼠建立動(dòng)物模型，為螺桿菌致病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡雌性SPF級(jí)C57BL/6野生型小鼠40只，體質(zhì)量約18～20 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SPF級(jí))，溫度20 ～22 ℃，濕度60%～70%，每日照明12 h(8∶00-20∶00)，飼料及飲水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。

1.2細(xì)菌的獲取10只豬胃購(gòu)自青島市某屠宰場(chǎng)，用無(wú)菌大剪刀沿胃大彎剪開(kāi)，以自來(lái)水仔細(xì)沖洗干凈后，用無(wú)菌載玻片分別刮取10只豬胃充血發(fā)紅炎性病變區(qū)域的粘液層及表層胃黏膜組織，然后各自收集于無(wú)菌離心管中，再加入適量無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)，充分研磨勻漿后各自定容為2.0 mL備用。

1.3主要試劑組織DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，PCR相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.4豬胃中H.suis的檢測(cè)各自取10只豬胃黏膜勻漿液0.5 mL置于1.5 mL離心管中，用組織DNA提取試劑盒提取總DNA(提取方法參照說(shuō)明書(shū))。PCR引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用25 μL反應(yīng)體系,每管依次加入Premix Tap酶12.5 μL、無(wú)菌雙蒸水8.5 μL、dNTP 2.0 μL及上下游引物各1.0 μL。H.suis16S rRNA引物、H.pylori16S rRNA引物及螺桿菌多重引物分別用于特異性檢測(cè)H.suis、H.pylori及其他常見(jiàn)螺桿菌 (H.felis,H.bizzozeronii和H.Salomonis)的存在。94 ℃預(yù)變性2 min后,以下條件PCR擴(kuò)增:94 ℃ 2 min,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸1 min。PCR反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照以已經(jīng)鑒定為H.suis的DNA為模板,空白對(duì)照以無(wú)菌雙蒸水替代模板。然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確定H.suis及其他主要螺桿菌的存在情況。

表1本研究中所用的PCR引物和擴(kuò)增產(chǎn)物大小

Tab.1PCR primers used in this study and the PCR product sizes

TargetgenesPrimersequencesAmplifiedproductlength(bp)H.suis-16SrRNA433Forward5'-TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA-3'Reverse5'-GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT-3'H.pylori-16SrRNA119Forward5'-TGCGAAGTGGAGCCAATCTT-3'Reverse5'-GGAACGTATTCACCGCAACA-3'H.felis,H.bizzozeroniiandH.salomonis16SrRNA73Forward5'-TGCGTAGGCGGGGTTGTAAG-3'Reverse5'-CAGAGTTGTAGTTTCAAATGC-3'

1.5感染模型構(gòu)建C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組,每組各20只。小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食禁水4 h。將6只經(jīng)PCR檢測(cè)證明存在H.suis的豬胃黏膜勻漿液混勻后，給予模型組每只小鼠0.5 mL豬胃黏膜勻漿液灌胃,對(duì)照組每只小鼠接受0.5 mL無(wú)菌PBS溶液灌胃，灌胃后禁食禁水4 h。

1.6小鼠胃組織的處理 各組小鼠灌胃1個(gè)月及3個(gè)月后，分別處死半數(shù)小鼠，取全胃沿胃大彎剪開(kāi),以無(wú)菌PBS溶液沖洗胃內(nèi)容物；取一半胃組織刮取黏膜層用于提取DNA行PCR反應(yīng)。另一半胃組織經(jīng)10%甲醛固定后石蠟包埋，10 μm連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色后檢測(cè)小鼠胃黏膜淋巴濾泡形成情況。

2　結(jié)　果

2.1豬胃黏膜中H.suis的存在情況分別從10只豬胃黏膜勻漿液中提取DNA，以H.suis特異性16S rRNA引物行PCR，其中6只豬胃可擴(kuò)增出433 bp的目的條帶，其余4只豬胃及空白對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果為陰性，未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(見(jiàn)圖1)。以H.pylori特異性16S rRNA引物和其他螺桿菌 (H.Felis,H.bizzozeronii和H.Salomonis) 多重引物及無(wú)菌雙蒸水行空白對(duì)照檢測(cè)，其結(jié)果均為陰性，未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。以上結(jié)果表明用于建立感染模型的豬胃中只存在H.suis這一常見(jiàn)的致病性螺桿菌。本實(shí)驗(yàn)中H.suis在豬胃中的感染率高達(dá)60%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2,4]。

H. suis 16S rRNA gene by PCR amplification; M: DNA marker; 1: Positive control, H. suis; 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11: pig gastric mucosa; 12: blank control, Sterile double distilled water. 圖1　10只豬胃黏膜中H. suis的鑒定結(jié)果Fig.1　Identification of H. suis in pig gastric mucosa

2.2小鼠胃黏膜中H.suis定植情況造模組小鼠接受豬胃黏膜勻漿液灌胃1個(gè)月與3個(gè)月后，分別取胃黏膜勻漿提取DNA，以H.suis特異性16S rRNA引物行PCR，均能擴(kuò)增出約433 bp的目的條帶。以H.pylori特異性16S rRNA引物和其他螺桿菌 (H.felis,H.bizzozeronii和H.Salomonis) 多重引物及無(wú)菌雙蒸水行空白對(duì)照檢測(cè)，其結(jié)果均為陰性，未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖2、3)。表明來(lái)源于豬黏膜的H.suis可在小鼠胃內(nèi)定植，3個(gè)月后仍穩(wěn)定存在，未被清除。

2.3小鼠胃黏膜病理組織學(xué)變化小鼠感染H.suis1個(gè)月及3個(gè)月后，其胃黏膜中均檢測(cè)到淋巴濾泡形成，且3個(gè)月時(shí)淋巴濾泡的大小較1個(gè)月時(shí)明顯增大。而對(duì)照組未檢測(cè)到胃淋巴濾泡的形成 (圖4)。

1, 2: H. suis 16S rRNA gene by PCR amplification; 3: H. pylori 16S rRNA gene by PCR amplification; 4: H. felis, H. bizzozeronii and H. salomonis special 16S rRNA gene by PCR amplification. M: DNA marker; 1: Positive control, H. suis; 2,3,4: mice gastric mucosa; 5: blank control, sterile double distilled water.圖2　感染H. suis 1個(gè)月后小鼠胃黏膜中H. suis的鑒定結(jié)果Fig.2　Identification of H. suis in the gastric mucosa of mice at 1 month postinfection

1, 2: H. suis 16S rRNA gene by PCR amplification; 3: H. pylori 16S rRNA gene by PCR amplification; 4: H. felis, H. bizzozeronii and H. salomonis special 16S rRNA gene by PCR amplification. M: DNA marker; 1: Positive control, H. suis; 2, 3, 4: mice gastric mucosa; 5: blank control, sterile double distilled water.圖3　感染H.suis 3個(gè)月后小鼠胃黏膜中H. suis的鑒定結(jié)果Fig.3　Identification of H. suis in the gastric mucosa of mice at 3 months after H. suis infection

A: control group at 1 month after PBS solution treatment;B: model group at 1 month after H. suis infection;C: control group at 3 months after PBS solution treatment;D: model group at 3 months after H. suis infection.圖4　各組小鼠胃黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE 染色,×200)Fig.4　Pathological changes in the gastric mucosa of mice in each group (HE staining, ×200)

3　討　論

H.pylori感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及胃MALT淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)[5]。為了探究其發(fā)病機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)H.pylori感染動(dòng)物模型進(jìn)行了大量的研究，但未經(jīng)改良的H.pylori菌株難以長(zhǎng)期定植于動(dòng)物胃內(nèi)，極大阻礙了H.pylori發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。Kim等人研究發(fā)現(xiàn)感染H.pylori80周的小鼠只是誘導(dǎo)出增生性胃炎、慢性萎縮性胃炎等癌前病變，并未出現(xiàn)胃癌[6]，這說(shuō)明單純H.pylori感染致癌的周期可能很長(zhǎng)。而作為胃內(nèi)的第2種螺桿菌，H.suis可穩(wěn)定定植于小鼠胃內(nèi)，較H.pylori更適用于胃MALT淋巴瘤發(fā)病機(jī)制的研究。H.suis感染后誘發(fā)的胃黏膜免疫反應(yīng)以Th1為主[7]，而Th1型免疫反應(yīng)在C57BL/6小鼠中占優(yōu)勢(shì)，且此類小鼠其遺傳背景明確、個(gè)體差異小、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單，各種處理因素容易控制，故本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6小鼠為造模對(duì)象。

既往國(guó)內(nèi)外大部分海爾曼螺桿菌的研究都集中于個(gè)案報(bào)道和流行病學(xué)調(diào)查。有學(xué)者報(bào)道經(jīng)胃鏡檢查可從患者胃粘膜活檢標(biāo)本中獲得海爾曼螺桿菌，進(jìn)而感染小鼠建立模型。但由于海爾曼螺桿菌(Hh)在人群中感染率較低(我國(guó)約為5%～11%)[8]，因此通過(guò)內(nèi)鏡獲取該菌較為困難。另外，Hh有著廣泛的動(dòng)物宿主，目前在豬、犬、貓、鼠、雪貂及包括人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物胃內(nèi)均可檢測(cè)出Hh[9]。感染者多與家畜與寵物，如豬、犬、貓等有密切接觸史，這些動(dòng)物可作為Hh傳播的貯存庫(kù)，人類與其直接接觸是導(dǎo)致感染Hh的危險(xiǎn)因素[10-11]。有研究報(bào)道屠宰后的豬胃中60%以上可檢測(cè)到H.suis[2,4]，其在生豬肉中可持續(xù)存活48 h以上，而在水中可存活4 d以上，因此接觸被污染的生豬肉及水源可能也是感染H.suis的途徑[12]，豬胃有望成為獲取該菌的重要來(lái)源。相關(guān)報(bào)道表明采用PCR法檢測(cè)H.suis16S rRNA證實(shí)該菌存在的敏感性和特異性均優(yōu)于免疫組化、尿素酶試驗(yàn)及姬姆薩染色等方法[13]，本實(shí)驗(yàn)采用PCR法在大部分豬胃及感染后 1個(gè)月與3個(gè)月的小鼠胃粘膜中均檢測(cè)到H.suis的存在，表明H.suis在豬胃中自然感染率較高，且未合并其他常見(jiàn)致病性螺桿菌的感染。H.suis可長(zhǎng)期穩(wěn)定定植于小鼠胃內(nèi)，保證了建立小鼠感染模型的可行性。

螺桿菌感染胃黏膜后可激活上皮細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，作用于間質(zhì)細(xì)胞使其分泌趨化因子，募集淋巴細(xì)胞形成獲得性的MALT。H.suis可以直接引起慢性炎癥，也可以通過(guò)驅(qū)動(dòng)胃上皮細(xì)胞壞死，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，進(jìn)而間接促進(jìn)炎癥[14]。慢性炎癥的長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)，形成以B細(xì)胞為主的MALT淋巴瘤[15]。在人類，H.suis主要定植于胃竇部, 位于黏液層、上皮細(xì)胞表面和胃小凹深部；而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，感染H.suis1個(gè)月后，小鼠胃竇粘膜層及粘膜下層有大量淋巴細(xì)胞聚集，形成了淋巴濾泡，且其大小隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明該模型可模擬人類感染H.suis后的病理變化。目前胃MALT淋巴瘤的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，深入研究Helicobacter感染后MALT形成的機(jī)制并進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)，對(duì)預(yù)防胃MALT淋巴瘤的發(fā)生具有重要意義。

綜上所述，H.suis感染C57BL/6小鼠模型的建立可成功誘導(dǎo)胃黏膜淋巴濾泡的形成，為我們進(jìn)一步研究胃MALT淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。雖然既往有H.suis分離成功的個(gè)例報(bào)道[16]，但多數(shù)學(xué)者在相同條件下重復(fù)試驗(yàn)均告失敗，無(wú)法進(jìn)行鑒定。故目前認(rèn)為H.suis在體外難以穩(wěn)定培養(yǎng)；本研究所用的細(xì)菌也來(lái)自豬胃，未經(jīng)純化。因此，為更好的研究H.suis在消化系統(tǒng)疾病中的具體致病機(jī)理，成功體外分離培養(yǎng)該菌并獲取純化菌株是今后努力的方向。

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Establishment of mice model withHelicobactersuisinfection and its significance

YANG Ruo-ming, YANG Lin, TIAN Zi-bin, YU Ya-nan,MAO Tao, LI Xiao-yu, ZHANG Shuai-qing

(DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China)

The aim of this study was to establish mice model withHelicobactersuis(H.suis) infection and explore its significance. A total of 40 female C57BL/6 mice were randomly divided into model group and control group. The mice in model group were given 0.5 mL pig gastric mucosal homogenates containingH.suisby gavage, while the mice in control group were given the same amount of PBS. After 1 month and 3 months, half of each group were randomly sacrificed and their gastric mucosa were taken out for PCR and HE staining respectively to detect theH.suiscolonization and the formation of lymphoid follicles in the stomach. Results showed thatH.suisexisted in pig gastric mucosal homogenates used for gavage and could colonize in the stomach of mice, which also existed at 3 months postinfection. The formation of gastric lymphoid follicles was detected in the stomachs of mice at 1 month and 3 months afterH.suisformation, and the size of follicles at 3 months postinfection increased significantly compared with that at 1 month postinfection. In conclusion, a mouse model ofH.suisinfection was established successfully.H.suisinfection can induce the formation of lymphatic follicles in C57BL/6 mice. Therefore it may play an important role in the development of gastric mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) Lymphoma.

H.suis; pig stomach; mice model; lymphoid follicles

Yang Lin, Email: bobotony@126.com

楊林，Email：bobotony@126.com

青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，青島266003

R378

A

1002-2694(2016)07-0604-04

2016-02-24；

2016-06-19

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.003

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 81572320)資助