劉志國(guó)，王　妙，劉日宏，趙鴻雁，樸冬日，崔步云，夏咸柱

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內(nèi)蒙古烏蘭察布布氏菌分離株種型鑒定及流行病學(xué)特征分析

劉志國(guó)1,2,3，王妙3，劉日宏3，趙鴻雁4，樸冬日4，崔步云4，夏咸柱5

目的鑒定臨床分離布氏菌種型，并分析患者的流行病學(xué)特征。方法以牛種、羊種、豬種標(biāo)準(zhǔn)參考菌株為試驗(yàn)對(duì)照，采用經(jīng)典方法和VITEK2.0進(jìn)行初步鑒定，用AMOS-PCR進(jìn)行確證，并分析患者的流行病學(xué)特征。結(jié)果經(jīng)典鑒定115株均為羊種菌，羊3型93株，羊1型22株；115株菌ProA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；91株ELLM陽性、14株APPA陽性，提示均為布氏菌，其中羊種菌91株，豬種菌14株。與經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的鑒定符合率比較鑒定布氏菌屬100%，鑒定布氏菌種為79%(91/115)；AMOS-PCR均獲得了約731 bp的特異性擴(kuò)增條帶，證實(shí)全部為羊種菌。初診患者84例，構(gòu)成比為73%；臨床表現(xiàn)以疼痛、發(fā)熱、乏力、多汗居多；88例患者就診前無用藥史，2例有布病治療史。結(jié)論VITEK2.0是一種高效的布氏菌鑒定方法，但不能替代經(jīng)典方法；羊種3型菌為該地區(qū)的主要流行菌種，再感染可能是慢性患者或有布病治療史患者分離到布氏菌的主要因素，初診、未用抗生素且癥狀典型是分離布氏菌的重要指標(biāo)。

布氏菌；種型鑒定；流行病學(xué)

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)

布氏菌病(布病)是由布氏菌屬細(xì)菌侵入機(jī)體引起的人獸共患傳染-變態(tài)反應(yīng)性疾病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疫病。布病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是全球特別是發(fā)展中國(guó)家面臨的主要公共衛(wèi)生問題[1-2]。中國(guó)是布病的歷史疫區(qū)，特別是在西北和東西地區(qū)，布病流行較為嚴(yán)重。進(jìn)入新世紀(jì)后，全國(guó)布病發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，疫點(diǎn)不斷增加[3]。在內(nèi)蒙古101個(gè)旗縣市區(qū)中有94個(gè)是人間布病歷史疫區(qū)。中國(guó)的布病病例約1/4來自內(nèi)蒙古，而2011年烏蘭察布市的布病病例數(shù)占內(nèi)蒙古的39.6%[4]。近年，在采取一系列重要舉措后，該地區(qū)布病的高發(fā)態(tài)勢(shì)得到了有效遏制，但人畜間布病防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻[5]。為了系統(tǒng)的了解烏蘭察布地區(qū)布病流行規(guī)律和病原特點(diǎn)，對(duì)分離的布氏菌菌株進(jìn)行多種方法的鑒定，對(duì)相應(yīng)患者的流行病學(xué)特征進(jìn)行分析，以期為該地區(qū)布病防控提供參考。

1　材料和方法

1.1菌株來源115株布氏菌分離自烏蘭察布市地方病防治中心就診的患者血液樣本，牛種(544A)、羊種(16M)、豬種(1330S)標(biāo)準(zhǔn)參考菌株來自于中國(guó)疾控中心傳染病所(傳染病所)布病室。布病實(shí)驗(yàn)室檢查、臨床癥狀記錄以及病例確認(rèn)判定均按照國(guó)家人間布病判定標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)蒙古人間布病診療方案(試行)執(zhí)行；活菌試驗(yàn)操作在傳染病所生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。在烏蘭察布的地區(qū)劃分中，習(xí)慣上以大青山以南部分稱為前山地區(qū)，以北部分稱為后山地區(qū)，具體地區(qū)名稱用WS1-11表示，周邊地區(qū)用ZB1-3表示，WS-12即地址未知。

1.2流行病學(xué)資料收集整理2011-2015年間在烏蘭察布市地方病防治中心分離的115株布氏菌的相關(guān)資料和病歷，包括性別、年齡、民族、職業(yè)、接觸史以及病原種型、病原分布、菌種地區(qū)分布、樣本及患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、臨床癥狀表現(xiàn)等有關(guān)情況進(jìn)行匯總分析。

1.3主要儀器與試劑全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 .0 Compact 、GN卡(革蘭陰性桿菌鑒定卡)(梅里埃)，麥?zhǔn)霞?xì)菌濁度儀(DENSIMAT型)、Class 11 A2型生物安全柜(美國(guó)Forma公司)，生化培養(yǎng)箱(上海一恒儀器公司)，24孔高速離心機(jī)、PCR儀(sigma 德國(guó))，水平電泳槽、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)，凝膠成像系統(tǒng)GelDoc-It310(北京天美儀器公司)，全自動(dòng)核酸提取儀及試劑TACO-3(臺(tái)灣瑞基海洋生物技術(shù)公司)。

1.4基因組DNA提取嚴(yán)格按照全自動(dòng)核酸提取儀TACO-3操作步驟和使用說明進(jìn)行試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)參考菌株的基因組DNA提取，測(cè)定核酸濃度(260/280)，標(biāo)記后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5經(jīng)典鑒定經(jīng)典鑒定方法包括標(biāo)準(zhǔn)陽性血清凝集試驗(yàn)；A、M單因子血清凝集試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、CO2需要、染料抑菌試驗(yàn)及噬菌體裂解試驗(yàn)，具體操作步驟遵照衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局《布魯氏菌病防治手冊(cè)》[6]。

1.6全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析取生長(zhǎng)48 h待檢布氏菌溶解于3 mL滅菌生理鹽水中，并稀釋為麥?zhǔn)蠞岫?.5，用封口膜封口，在封口膜中央靠近VITEK卡槽的一端用無菌銳器扎一小口，將GN鑒定卡導(dǎo)管插入菌懸液中，上機(jī)鑒定，鑒定完畢后及時(shí)將廢棄物高壓滅菌處理，并做好廢物倉消毒滅菌。鑒定結(jié)果分析參照梅里埃(GN卡)布氏菌屬和種的生化陽性鑒定標(biāo)準(zhǔn)和參考菌株結(jié)果。

1.7AMOS-PCR采用25 μL擴(kuò)增體系。2×Premix Taq 10 μL，primer IS711(10 pmol/μL)1 μL；primer A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL；DNA 1 μL，高壓雙蒸水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增參數(shù):95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；終末延伸72 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)。經(jīng)2%凝膠電泳，120 V，1 h檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2　結(jié)　果

2.1經(jīng)典鑒定結(jié)果115例患者血清琥紅平板凝集試驗(yàn)全部陽性，其中114例的試管凝集效價(jià)1∶100(++)，1例為1∶100(+)。22株為羊種1型菌，93株為羊種3型菌。見表1。

表1115株臨床分離布氏菌經(jīng)典鑒定結(jié)果表

Tab.1Classical methods identified result of 115 clinical isolated Brucella

IDSerologicaltestPositiveserumAseraMseraCO2requirementH2SproductionDyeinhibitiontestsPhagelysistestthioninefuchsineBK2104TbWBNo.ofstrainsSpecies/Biovar16M+-+--+++--1羊1544A++-±--+++-1牛11330S++---+-+++1豬122株+-+--+++--22羊193株+++--+++--93羊3

2.2VITEK 2.0實(shí)驗(yàn)結(jié)果3株參考菌株P(guān)roA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；牛種參考菌株乳酸鹽產(chǎn)堿(1IATK)、ELLMAN(ELLM)陽性；羊種參考菌株ELLMAN(ELLM)、dGLU(D-葡萄糖)陽性；豬種參考菌株APPA陽性； 115株試驗(yàn)菌株的ProA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；91株ELLM陽性、14株APPA陽性、11株dGLU陽性，PyrA、H2S和GGAA陽性各1株，提示菌株全部為布氏菌。91株為羊種菌，14株為豬種菌，與經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的鑒定符合率為79%(91/115)。生化實(shí)驗(yàn)了共檢測(cè)64項(xiàng)生化指標(biāo)，本試驗(yàn)中11個(gè)生化指標(biāo)對(duì)布氏菌鑒別分析有意義，其余均為陰性，為非布氏菌鑒別指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)每次8 h內(nèi)完成。見表2。試驗(yàn)菌株的耗時(shí)數(shù)和可信度均為平均值，耗時(shí)范圍為6.25～8，可信度范圍為97%～99%；ProA為L(zhǎng)脯氨酸芳胺酶；TyrA為酪氨酸芳胺酶；URE為尿素酶；GIyA為氨基乙酸芳胺酶；1LATK為乳酸鹽產(chǎn)堿；ELLM為ELLMAN；APPA為丙氨酸-苯丙氨酸一脯氨酸芳胺酶；dGLU為D-葡萄糖；PyrA為吡咯烷基芳胺酶；H2S為硫化氫產(chǎn)生；GGAA為谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶。

2.3AMOS-PCR鑒定結(jié)果經(jīng)擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，陽性對(duì)照擴(kuò)增獲得了預(yù)期片段，分別為牛種498 bp、羊種731 bp、豬種275 bp；陰性對(duì)照未見擴(kuò)增。試驗(yàn)菌株均獲得了單一、特異的約731 pb擴(kuò)增條帶，條帶與對(duì)照羊種菌產(chǎn)生的條帶一致，判定為羊種布氏菌。詳見圖1。

表2115株布氏菌全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果

Tab.2Automatic biochemical identification results of 115 Brucella strains

菌株Strains牛種B.abortus羊種B.melitensis豬種B.suis試驗(yàn)菌株TeststrainsNo.ofstrains111115Time-consuming86.7587.7probability(%)98999898.8proA111115TyrA111115URE111115GlyA111115Test1LATK1---resultELLM11191APPA--114dGLU-1-11PyrA---1H2S---1GGAA---1

1-3 as positive control, B. abortus 544A, B. melitensis 16M, B. suis 1330S, respectively; 4-47, test strains; lane, 48 negative control圖1　布氏菌AMOS-PCR鑒定結(jié)果Fig.1　Identification result of Brucella by AMOS-PCR

2.4病例特征分析

2.4.1性別、民族和職業(yè)分布在115例患者中，84(73%)例為男性，31(29.6%)例為女性，男女比例約為2.7∶1；112為漢族，2名為蒙族，1名不詳，漢族的構(gòu)成比為97.4%；農(nóng)民99名，構(gòu)成比為86%(99/115)、牧民 2名，學(xué)生9名，司機(jī) 2名，市民 2名，個(gè)體1名(經(jīng)營(yíng)超市)；布病對(duì)性別、民族無選擇性，僅與接觸有關(guān)。

2.4.2年齡分布患者主要集中在40～69歲年齡范圍，共計(jì)83例，構(gòu)成比約為72.2%(83/115)，最小為7歲，最大為71，平均年齡46歲。

2.4.3接觸史和發(fā)病時(shí)間115名患者均直接或間接與羊及其產(chǎn)品有接觸史，其中初診84(73%)名，復(fù)診27名，不詳3名。從發(fā)病后就診時(shí)間來看，發(fā)病后30 d之內(nèi)前來就診人數(shù)最多，為34(29.5%)例；10 d之內(nèi)為14例，60 d之內(nèi)11例，半年之內(nèi)14例，1年之內(nèi)前來就診人數(shù)23例；1年以上為5例，不詳14例。

2.5臨床表現(xiàn)布病患者大多數(shù)以疼痛、發(fā)熱、乏力、多汗為主。88例表現(xiàn)疼痛、54例發(fā)熱、34例乏力、14例多汗。疼痛以腿疼居多，主要包括膝關(guān)節(jié)和大、小腿肌肉困疼，活動(dòng)受限；全身疼表現(xiàn)為全身游走性的關(guān)節(jié)和肌肉酸疼；腰疼多為腰部僵直或單側(cè)腰部疼痛；關(guān)節(jié)疼以骶髂、胯和肩關(guān)節(jié)等大關(guān)節(jié)疼痛為主。綜合癥狀以疼痛和發(fā)熱最多，其次伴有乏力、多汗、頭疼、頭暈、胃部不適等多種癥狀。提示癥狀典型可作為分離布氏菌的篩選指標(biāo)，疼痛、發(fā)熱為必要指標(biāo)。

表3疼痛癥狀分布

Tab.3Distribution of pain symptom

疼痛Pain腿疼Legpains全身疼Bodyaches腰疼Lumbago關(guān)節(jié)疼Jointpain頭疼Headache胯疼Hippain腳疼Footpain總計(jì)TotalNo.ofcases2717171593288Proportion(%)301919171032100

2.6種型及地理分布93株羊種3型菌和22株羊種1型布氏菌分布于烏蘭察布市的11個(gè)旗縣市區(qū)以及周邊鄰近的錫盟朱日和、張家口尚義和大同市郊區(qū)等地；涉及56個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)(蘇木)，88個(gè)自然村(嘎查)；提示羊種3型和1型布氏菌是該地區(qū)布病的主要致病菌和流行菌種，混合共存，未分離到其它種型的布氏菌。分布見表4。

表4布氏菌地區(qū)及種型分布

Tab.4Region and type distribution of Brucella

旗縣市區(qū)Districts分區(qū)regions菌株數(shù)No.ofstrains旗縣Districts分區(qū)Regions鄉(xiāng)鎮(zhèn)數(shù)No.oftowns村數(shù)No.ofvillages種型及數(shù)量Speciesandnumber羊3型B.melitensisbv.3羊1型B.melitensisbv.1WS-14762340WS-220718182WS-3前山地區(qū)22613175WS-4Qianshanregion18713144WS-555541WS-674661WS-79294663WS-8后山地區(qū)63651WS-9Houshanregion98972WS-1044440WS-1111101ZB-1151110ZB-2周邊地區(qū)32230ZB-3Neighbouringregions11110WS-12Unknown55--32Total4115≥56≥889322

2.7就診前是否用藥及用藥情況就診采樣前未服用藥物88例；25例曾服用抗生素、感冒藥、中藥和腰疼藥，未服用治療布病藥物；有2例服用布病治療藥物。但使用抗生素后患者仍有布病典型癥狀，仍可進(jìn)行布氏菌分離培養(yǎng)。

3　討　論

目前，布氏菌種型鑒定方法較多，但從實(shí)用性和可操作性方面考慮來講，以經(jīng)典鑒定和分子鑒定最為常用。全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)vitek 2.0基于細(xì)菌生化代謝反應(yīng)在屬的水平上鑒別布氏菌，自動(dòng)化程度高，可同時(shí)大批量(60株)的鑒定，結(jié)果以PDF形式輸出，保存方便，易于解讀。但vitek 2.0鑒定需操作活菌，涉及生物安全，需要注意。此次試驗(yàn)共對(duì) 118株對(duì)照和分離菌株進(jìn)行了生化鑒定。118株試驗(yàn)菌株的ProA、TyrA、URE和GIyA 均為陽性，結(jié)果表明為布氏菌，與經(jīng)典實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合；其中91株鑒定為羊種菌，14株鑒定為豬種菌，與經(jīng)典鑒定符合率為79%(91/115)。標(biāo)準(zhǔn)菌株與試驗(yàn)菌株的鑒定可信度與先期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，試驗(yàn)菌株的可信度>標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定可信度；鑒定耗時(shí)本研究的試驗(yàn)菌株平均耗時(shí)7.7 h，略高于先前的研究[7]。試驗(yàn)表明在屬的水平上的鑒別結(jié)果較為一致。全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)鑒定的14株豬種菌和其余試驗(yàn)菌株經(jīng)AMOS-PCR鑒定確證均為羊種布氏菌，AMOS-PCR與經(jīng)典方法的鑒定結(jié)果具有很高的一致性[8-9]。66%(76/115)的布氏菌分布前山地區(qū)，而后山地區(qū)的發(fā)病率明顯高于前山，未知具體地點(diǎn)的菌株均來自于烏蘭察布境內(nèi)。布氏菌的分布與布病發(fā)病率的差異可能是由于該試驗(yàn)為被動(dòng)監(jiān)測(cè)，樣品均來自固定地點(diǎn)、臨床醫(yī)師的首診偏差和漏報(bào)等多種因素造成，并未全面反映該地區(qū)的布氏菌的地理分布特征，但證實(shí)了羊種布氏菌在該地區(qū)分布較廣，并在周邊地區(qū)均有分布。提示控制人的疫情首先從控制羊的疫情入手，其它種型布氏菌在該地區(qū)的人間布病疫情中發(fā)揮較次要的作用。

布病的感染與性別、職業(yè)、年齡等因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要與接觸患病動(dòng)物相關(guān)[10]。25例患者就診前有非布病藥物治療史，表明其它藥物對(duì)布氏菌影響較小。用非布病治療藥物史的患者大多屬誤診。因布病的臨床表現(xiàn)不典型，在首診時(shí)應(yīng)結(jié)合癥狀仔細(xì)詢問病史、接觸史，在鑒別診斷中應(yīng)進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，以減少誤診[11]。2例患者經(jīng)口服利福噴丁和四環(huán)素治療40 d后，且仍有布病癥狀也分離到了布氏菌，需要進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)和耐藥相關(guān)基因檢測(cè)以及從分子生物學(xué)方法入手，以期獲得再感染和確證是否為耐藥菌株[12]。

布病患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)全身性、多器官受損癥候[13]。本研究中大多數(shù)患者仍表現(xiàn)為典型的布病癥狀，以腿疼居多，大、小腿的肌肉和膝、髖關(guān)節(jié)均有疼痛。全身疼的患者主訴為全身疲乏無力、喜臥，并以全身大關(guān)節(jié)和肌肉游走性酸痛為主；關(guān)節(jié)疼以骶髂、髖、肩、膝等為主。腰疼多表現(xiàn)為左側(cè)或兩側(cè)腰部酸疼或困疼，從而引發(fā)胯部、下肢等不適癥狀，提示布病主要侵害較大的負(fù)重關(guān)節(jié)[14]。急、慢性期患者均可表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)和肌肉疼痛。急性期患者疼痛多呈大關(guān)節(jié)游走性疼痛且較劇烈。慢性期以運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的損傷最為明顯，多為鈍痛持續(xù)性疼痛?？傊疾〉呐R床表現(xiàn)復(fù)雜多變,癥狀各異。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)臨床分離株種型的鑒定和患者流行病學(xué)特點(diǎn)的分析，掌握了該地區(qū)布病流行規(guī)律和特點(diǎn)，闡明了布病種型和地理分布特征，明確了篩選患者開展血樣布氏菌分離培養(yǎng)的主要指標(biāo)，對(duì)今后的深入研究和本地區(qū)布病防控具有重要意義。

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Species identification and epidemiological characteristics analysis ofBrucellain Ulanqab, Inner Mongolia, China

LIU ZHi-guo1,2,3, WANG Miao3, LIU Ri-hong3, ZHAO Hong-yan4,PIAO Dong-ri4, CUI Bu-yun4, XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China;2.HealthandFamilyPlanningCommissionofUlanqab,Ulanqab012000,China;3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControlandProvention,Ulanqab012000,China;4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China;5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

The aim of present study is to identify species/biovar ofBrucellaclinical isolates and to analyze epidemiological characteristics of brucellosis patients. StandardBrucellastrains includingB.abortus,B.melitensis, andB.suiswere used as positive controls. Automatic microbial identification system vitek 2.0 and classical biotyping methods were used for preliminary identification, and then further examined by AMOS-PCR. Epidemiological features of 115 patients were analyzed. Classical identification showed that 115 strains ofBrucellawere allB.melitensis, including 93B.melitensisbiovar 3 strains and 22B.melitensisbiovar 1 strains. All these strains exhibited positive results with ProA, TyrA, URE and GIyA, implying that all strains wereB.melitensis. While there were 91 strains with ELLM positive reaction and 14 strains with APPA positive reaction, indicating that there might be 91B.melitensisstrains and 14B.suisstrains. Compared with classical methods, the Vitek showed a coincidence rate of 100% and 79% on genus and species identification, respectively. A specific 731 bp amplified products were detected for every strain in AMOS-PCR, confirmed that all tested strains wereB.melitensis. There were 84 newly diagnosed patients, covering 73%, with the major clinical symptoms of pain, fever, weakness and sweating. The 88 patients hadn’t taken any medication before diagnosis, while two had a treatment history for brucellosis. Vitlk 2.0 system is an efficient method forBrucellaidentification, but it can not replace classical identification methods yet.B.melitensisbiovar 3 is the major epidemic strains in this region.Brucellaisolated from patients with chronic brucellosis or with treatment history for brucellosis might be because of reinfection. Newly diagnosed patients, no antibiotic treatments and obvious symptoms were important index for obtainingBrucella.

Brucella; species identification; epidemiology

Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn

夏咸柱，Email: xiaxzh@cae.cn

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018；2.烏蘭察布市衛(wèi)計(jì)委，集寧012000；3.烏蘭察布市地方病防治中心，集寧012000；4.中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；5.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122

R378.5

A

1002-2694(2016)07-0618-05

2016-01-13；

2016-06-20

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.006

內(nèi)蒙古衛(wèi)計(jì)委醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(No.201301094)資助