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(深圳大學(xué)過敏反應(yīng)和免疫學(xué)研究所，深圳518060)

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DDC對嬰兒雙歧桿菌SOD酶活性的影響①

羅燕②葛蘭③陳紅兵②楊平常劉志剛楊波④

(深圳大學(xué)過敏反應(yīng)和免疫學(xué)研究所，深圳518060)

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300292)、廣東省對外科技合作項(xiàng)目(No.2013B051000088)、深圳市科技計(jì)劃國際科技合作項(xiàng)目(No.GJHZ20130408174112021)和深圳市科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.JCYJ20140418095735538、JCYJ20140828163633991)。

②南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330047。

③深圳科興生物工程有限公司，深圳518060。

④深圳大學(xué)光電工程學(xué)院光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060。

目的：探討二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)對嬰兒雙歧桿菌超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用。方法：采用厭氧活化擴(kuò)增法培養(yǎng)嬰兒雙歧桿菌，根據(jù)繪制出的最適生長曲線，在平臺生長期內(nèi)加入不同濃度(200、1 000 μmol/L)的DDC作用一段時間(0、0.5、1、2、4、24 h)，然后離心收集細(xì)菌、進(jìn)行超聲破碎，測定細(xì)菌裂解液中SOD的活性。作為陽性對照，我們也檢測了DDC對小鼠腸道裂解液中SOD活性的影響。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)上述不同濃度的DDC作用于嬰兒雙歧桿菌一定時間后，對其SOD活性無顯著影響。動物實(shí)驗(yàn)表明DDC作用于小鼠一定時間后，與對照組相比，其SOD活性顯著降低(P<0.01)。結(jié)論：DDC影響小鼠體內(nèi)SOD活性，但不影響嬰兒雙歧桿菌SOD的活性。推斷嬰兒雙歧桿菌SOD抑制劑不是DDC，SOD抑制劑尚需進(jìn)一步研究。

二乙基二硫代氨基甲酸酯；抑制劑；嬰兒雙歧桿菌；超氧化物歧化酶

雙歧桿菌是由法國巴斯德研究所的Henry Tissier于1989年從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到的。它是發(fā)現(xiàn)最早的生理性細(xì)菌之一。目前，常見的雙歧桿菌主要有5個菌種，包括：長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、雙叉嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌。其中嬰兒雙歧桿菌是嬰兒腸道內(nèi)的一種優(yōu)勢菌種，具有抗氧化、抗腫瘤、維持腸道正常菌群平衡、提高免疫力等生理功能[1]。Sekine等[2]人研究了嬰兒雙歧桿菌細(xì)胞壁對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的激活作用，結(jié)果表明其可使IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)增強(qiáng)。同時，該研究還證實(shí)嬰兒雙歧桿菌能顯著抑制小鼠皮下移植的纖維肉瘤的生長[3]。國內(nèi)也有一些相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)了上述國外研究者報道的嬰兒雙歧桿菌的生物活性[4]。Talwalkar等[5]報道了雙叉型雙歧桿菌有抗氧化的能力，并發(fā)現(xiàn)其無細(xì)胞提取物具有超氧化物酶(Superoxide dis-mutase,SOD)活性。目前還未見關(guān)于嬰兒雙歧桿菌抗氧化活性的報道。SOD活性是嬰兒雙歧桿菌抗氧化功能的重要指標(biāo)，為了進(jìn)一步探討其抗氧化活性的作用機(jī)制，目前亟需確定嬰兒雙歧桿菌SOD的有效抑制劑。因此，本文首次研究了嬰兒雙歧桿菌的生長規(guī)律，并選取最常見的SOD抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸酯(Diethyldithiocar-bamate,DDC)[6,7]加入到預(yù)先培養(yǎng)的嬰兒雙歧桿菌菌液中[8,9]，分析其SOD活性。

1　材料與方法

1.1材料SPF級BALB/c雌性小鼠，6～8周，體重18～23 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，嬰兒雙歧桿菌(SQC013-2)購自深圳科興生物工程有限公司，DDC購自美國Sigma公司，SOD試劑盒購自南京建成生物工程公司，BCA蛋白濃度試劑檢測盒購自北京索萊寶科技公司，益生菌TPY液體培養(yǎng)基購自青島高科技園海博生物公司。

1.2方法

1.2.1嬰兒雙歧桿菌增菌培養(yǎng)取4支含有15 ml TPY液體培養(yǎng)基的試管，分別接種0.05、0.1、0.2 ml雙歧桿菌凍干粉末到15 ml的TPY液體培養(yǎng)基中，充分混勻，封口膜密封，其中1支不接種，作為陰性對照。將4支試管置于37℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。

1.2.2菌液OD600的測定及最適生長曲線的繪制分別培養(yǎng)0、4、8、20、24 h取出0.5 ml菌液用酶標(biāo)儀測定OD值，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次，測得其平均吸光值。以嬰兒雙歧桿菌菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，所測菌液的平均OD600值為縱坐標(biāo)，參考大腸桿菌的生長曲線圖[10]繪制出嬰兒雙歧桿菌達(dá)到穩(wěn)定期時(OD600約為1.0)的最適生長曲線圖。

1.2.3DDC處理預(yù)先培養(yǎng)的嬰兒雙歧桿菌選取上述最適培養(yǎng)條件，培養(yǎng)分裝得到12支含有嬰兒雙歧桿菌TPY菌液，分成兩組。第一組在培養(yǎng)第0、20、22、23、23.5 h，每管分別加入200 μmol/L濃度的DDC。另外一組，用同樣的方法將1 000 μmol/L濃度的DDC也加入到嬰兒雙歧桿菌中，每組有一支菌液不加DDC(0 h)作陰性對照[11-14]。

1.2.4DDC處理小鼠實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分為2組，每組7只。參考Khadlga等方法[15]給小鼠皮下注射DDC[400 mg/(kg·d)，隔天一次，共7次]，2周后處死小鼠。提取其腸道組織物，測定SOD活性，另外一組小鼠注射相同劑量的生理鹽水作為陰性對照。

1.2.5樣本SOD活性測定嬰兒雙歧桿菌提取物按照戴佳錕等[16]的方法，進(jìn)行細(xì)菌破壁并略作優(yōu)化。每毫升菌液(1×108CFU/ ml)，1 400 r/min離心5 min，收集菌體。加入一定量的蛋白裂解液和酶抑制劑重懸菌體，置于冰上超聲裂解。超聲破碎條件為功率300 W、時間10 min、時間間隔(工作時間∶間歇時間)為10∶10(s/s)，菌液渾濁至透明表示裂解完全。采用液氮研磨法提取小鼠空腸蛋白。以上兩種提取物均采用高速離心機(jī)(10 000 r/min ，4℃，20 min)離心沉淀取上清蛋白，BCA試劑盒檢測其蛋白濃度，然后用試劑盒測定嬰兒雙歧桿菌無菌體內(nèi)容物SOD酶活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

2　結(jié)果

由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度呈正比，因此測得的OD600值可以反映出菌液的濃度,OD值越大,說明生長的細(xì)菌越多。由表1可以看出，不同體積的凍干菌粉末在TPY培養(yǎng)基中隨著培養(yǎng)時間的延長，OD600值先增大，后又逐漸平穩(wěn)，相鄰時間段內(nèi)細(xì)菌數(shù)呈顯著性增長(P<0.05)。說明嬰兒雙歧桿菌懸液中的細(xì)菌總數(shù)隨著培養(yǎng)時間的延長經(jīng)歷了一個先增多后穩(wěn)定的過程。通過了解細(xì)菌的生長規(guī)律，我們選取了有效體積的凍干菌粉末于TPY培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2嬰兒雙歧桿菌最適生長曲線繪制以0.1 ml嬰兒雙歧桿菌凍干粉菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以各時間點(diǎn)所測得菌液的吸光值OD600為縱坐標(biāo)，繪制出嬰兒雙歧桿菌(SQC013-2)的最適生長曲線，見圖1。

表1　三種體積嬰兒雙歧桿菌在不同時間的OD600值間的差異性分析Tab.1　Different OD600 among three kinds of BB volume

表2　BCA試劑盒測定嬰兒雙歧桿菌蛋白濃度Tab.2　Protein concentrations of BB by BCA kit

圖1　嬰兒雙歧桿菌的最適生長曲線圖Fig.1　Growth curve of BB

圖2　200 μmol/L濃度DDC對嬰兒雙歧桿菌SOD活性的作用Fig.2　Effect of DDC (200 μmol/L) on activity of SOD of BB

圖3　1 000 μmol/L濃度DDC對嬰兒雙歧桿菌SOD活性的作用Fig.3　Effect of DDC (1 000 μmol/L) on activity of SOD of BB

圖4　DDC對小鼠腸道SOD活性的作用Fig.4　Effect of DDC on activity of SOD of murine intestineNote: *.P<0.01,Compared with ctrl group.

2.3DDC對嬰兒雙歧桿菌SOD活性的作用按照以上條件培養(yǎng)24 h后(達(dá)到平臺生長期)，加入不同濃度的DDC作用于嬰兒雙歧桿菌菌液，用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌裂解法提取蛋白物，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，結(jié)果見表2。用SOD試劑盒檢測嬰兒雙歧桿菌蛋白裂解物，分別測得200 μmol/L和1 000 μmol/L濃度的DDC作用雙歧桿菌的抑制率，計(jì)算出單位內(nèi)酶的活性，結(jié)果見圖2和圖3，與陰性對照組相比，各組間差異無顯著性意義(P>0.05)。DDC作用小鼠后，采用上述同樣方法測定腸道組織提取物的蛋白濃度和SOD酶活性(P<0.01)，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDC可顯著抑制小鼠腸道組織中SOD的活性。

3　討論

一定數(shù)量的細(xì)菌，接種于合適的液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)時，其生長過程具有先增長后平穩(wěn)的規(guī)律。本研究將嬰兒雙歧桿菌接種于TPY液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)，其生長也符合這一規(guī)律。

本次試驗(yàn)中，摸索三種體積的嬰兒雙歧桿菌，在密閉的15 ml含有TPY培養(yǎng)基的離心管中(最適合本實(shí)驗(yàn)的生長規(guī)律的菌樣體積)。腸道益生菌需要保持很高的活菌數(shù)才能發(fā)揮其生理功能，因此本實(shí)驗(yàn)最終確定體積為0.1 ml的嬰兒雙歧桿菌，在平穩(wěn)期OD600=1左右，對應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量為1×108CFU/ ml。在這個范圍內(nèi)嬰兒雙歧桿菌處于穩(wěn)定期，細(xì)菌總數(shù)是整個生長階段最多的，能夠發(fā)揮較好的生物活性作用。此時，將DDC加入預(yù)處理的嬰兒雙歧桿菌菌液作用不同的時間，測定DDC對嬰兒雙歧桿菌SOD的抑制率，計(jì)算出嬰兒雙歧桿菌細(xì)胞內(nèi)的SOD活性，結(jié)果顯示DDC不影響嬰兒雙歧桿菌型SOD活性。而動物實(shí)驗(yàn)表明，DDC能抑制動物體內(nèi)的SOD活性，與先前研究者報道一致[15]。說明DDC對嬰兒雙歧桿菌的SOD不起作用。

眾所周知，SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，在微生物及動植物中均有發(fā)現(xiàn)，主要分為三類：鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)[17]和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)[18]。近期國內(nèi)外研究報道，DDC是常見真核類Cu/Zn-SOD抑制劑[19]，同時DDC也能夠抑制大腸桿菌中的SOD活性[20]。設(shè)想DDC可能也和以往研究者發(fā)現(xiàn)的一樣能夠抑制嬰兒雙歧桿菌體SOD活性，但實(shí)驗(yàn)并沒有出現(xiàn)我們預(yù)期設(shè)想的結(jié)果。提示嬰兒雙歧桿菌中的SOD可能不屬于Cu/Zn-SOD，其抑制劑的類型還需要進(jìn)一步探討，以便完善嬰兒雙歧桿菌抗氧化活性功能的機(jī)制研究。

嬰兒雙歧桿菌作為嬰兒腸道內(nèi)最重要的優(yōu)勢生理菌群,降低過敏性疾病的發(fā)生，能夠黏附腸道抑制致病菌，從而減少內(nèi)毒素、胺類等毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，防止其對腸道的毒害，起到保護(hù)腸道的作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。在食品工業(yè)界內(nèi)可用作日常飲料和食品的添加劑,用于機(jī)體胃腸道功能紊亂等疾病的防治,因而有著巨大的潛在應(yīng)用價值。研究嬰兒雙歧桿菌抗氧化活性是探討其生物活性機(jī)制的重要指標(biāo)之一，故研究其SOD抑制劑的類型對抗氧化機(jī)制的研究具有重要意義。

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[收稿2015-10-21修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Effect of DDC on activity of SOD of Bifidobacteria infantis

LUO Yan，GE Lan，CHEN Hong-Bing，YANG Ping-Chang，LIU Zhi-Gang，YANG Bo.Institute of Allergy and Immunology,School of Medicine,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China

Objective:To investigate whether diethyldithiocarbamate (DDC) affect the activity of superoxide dismutase (SOD) of Bifidobacterium infantis (BB).Methods: We used simple anaerobic activated ways to culture BB.After the bacterium reached platform growth period,two concentrations (200 and 1 000 μmol/L) of DDC were added to bacterium medium for a specific period of time (0.5,1,2,4 and 24 h),which was in order to determine if this inhibitor affected the activity of SOD.As a positive control,the inhibitory effect of DDC on the activity of SOD in murine intestinal samples was also checked.Results: It was found that incubation of BB with DDC for some specific periods showed no effect on the activity of SOD.However,the activity of SOD in intestine reduced dramatically after the mice were given DDC in vivo.Conclusion: DDC affect the SOD activity in mice,while it showed no effect on SOD activity of BB.The suitable inhibitor for SOD of BB is not commercially available and further research is warranted.

Diethyl dithiocarbamate;Inhibitor;Bifidobacterium infantis;Superoxide dismutase

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.004

R3文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1103-04

羅燕(1989年-)，女，碩士，主要從事預(yù)防免疫學(xué)方面研究，E-mail:18566660351@163.com。

及指導(dǎo)教師：楊波(1983年-)，女，博士，主要從事過敏性疾病研究，E-mail:ybbio@163.com。