廖碧釵

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

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鹽酸土霉素在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留研究

廖碧釵

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

在水溫(25±2)℃條件下，以15 mg/kg魚(yú)體重的劑量給奧尼羅非魚(yú)單次口灌鹽酸土霉素，采用高效液相色譜法測(cè)定血漿和肌肉組織中的藥物濃度，研究鹽酸土霉素在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的代謝及消除規(guī)律。結(jié)果顯示：血藥時(shí)間數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，半衰期(T1/2Ka、T1/2α、T1/2β)分別為4.79、4.10、45.20 h，最大血藥濃度為1.50 μg/mL，達(dá)峰時(shí)間為7.30 h，藥時(shí)曲線下面積(AUC)為42.35 μg·h/mL。肌肉作為可食性組織，選取肌肉組織作為殘留檢測(cè)的靶組織，以0.1 mg/kg為最高殘留限量，在本試驗(yàn)條件下，建議休藥期不低于10 d。

鹽酸土霉素；奧尼羅非魚(yú)；藥代動(dòng)力學(xué)；殘留

鹽酸土霉素(Oxytetracycline hydrochloride，OTC)是四環(huán)素類抗生素，為廣譜抗生素，用于治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，如淡水魚(yú)類爛鰓病、腸炎病、赤皮病等[1-4]。其作用主要是通過(guò)細(xì)胞的核糖體，抑制蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)細(xì)胞壁通透性，導(dǎo)致細(xì)胞壁外泄而起到殺菌作用[5]。據(jù)報(bào)道[6]，OTC具有免疫抑制作用，長(zhǎng)期使用會(huì)使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，且易與Ca2+結(jié)合，從而影響牙齒和骨骼的發(fā)育。因此，魚(yú)肉中OTC的殘留對(duì)人類的影響備受關(guān)注。

世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國(guó)政府對(duì)動(dòng)物肌肉中OTC的殘留都做出了嚴(yán)格規(guī)定，規(guī)定其殘留限量不得高于100 μg /kg[7-8]。因此，控制OTC的使用，實(shí)施對(duì)動(dòng)物性食品中OTC殘留的檢測(cè)十分重要。于相滿等[9]對(duì)OTC在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究，但未對(duì)其在肌肉組織中的殘留進(jìn)行研究。本研究結(jié)合當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)的實(shí)際情況進(jìn)行給藥，以期掌握其藥動(dòng)學(xué)及殘留消除規(guī)律，最大限度地減少OTC殘留在養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)環(huán)境的影響和對(duì)人體的危害，為制定休藥期提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

健康奧尼羅非魚(yú)(Oreochromisaureus×O.niloticus)，由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供，平均體重(250±10)g，水溫控制在(25±2)℃，試驗(yàn)前3 d停止喂食，試驗(yàn)用飼料為福清三華飼料有限公司生產(chǎn)的人工配合飼料，試驗(yàn)用奧尼羅非魚(yú)經(jīng)抽查檢測(cè)證實(shí)血漿和肌肉組織中均不含OTC。OTC標(biāo)準(zhǔn)品(含量98.5%，Sigma公司)、乙腈(HPLC)、乙酸乙酯(A.R)、磷酸二氫鈉(A.R)、三氯乙酸(A.R)。

1.2色譜條件

Agilent 1200型高效液相色譜儀；Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相為乙腈：0.01 mol/L NaH2PO4溶液(v/v)=20∶80；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣體積100 μL；室溫。

1.3配制標(biāo)準(zhǔn)貯備液

準(zhǔn)確稱取OTC標(biāo)準(zhǔn)品0.10 mg，于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4給藥方法及采樣

精確稱取OTC標(biāo)準(zhǔn)品150.0 mg，置于100 mL燒杯中，加入適量預(yù)先煮成濃稠狀的人工配合飼料，攪拌均勻，定容至100 mL。試驗(yàn)用魚(yú)稱重，按15 mg/kg單劑量口灌給藥，不回吐的魚(yú)用于試驗(yàn)。給藥后0.5、1、2、4、7、10、16、24、48、72、120、360和720 h心臟采血，5 000 r/min離心10 min，取血漿。采血后，迅速鈍擊致死，取背脊兩側(cè)肌肉，放入樣品袋標(biāo)記好。每個(gè)采樣點(diǎn)采4尾魚(yú)，4個(gè)平行。試驗(yàn)前取空白樣品作對(duì)照，樣品于-20℃保存。

1.5制樣

1.5.1制血漿樣

取1.0 mL血漿，加1 mL 4%三氯乙酸-磷酸氫二鈉溶液和5 mL乙酸乙酯旋渦混合5 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)以上操作步驟，進(jìn)行第二次萃取，合并上清液。氮?dú)饬?40℃)吹干，加流動(dòng)相1.0 mL溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。

1.5.2制肌肉樣

取1.0 g肌肉組織，加1 mL 4%三氯乙酸-磷酸氫二鈉溶液和20 mL乙酸乙酯旋渦混合5 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)以上操作步驟，進(jìn)行第二次萃取，合并上清液。氮?dú)饬?40℃)吹干，加流動(dòng)相1.0 mL溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。

1.6制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

將一系列不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)貯備液依次加入到各空白樣品中，制成含標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000和2.500 μg/mL(μg/g)的溶液，按1.5的方法制樣，以各組分的色譜峰面積對(duì)濃度作線性回歸，得血漿和肌肉的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7測(cè)定回收率和精密度

取空白樣品，制成含0.100、0.500和2.500 μg/mL(μg/g)OTC的添加樣品。按1.5的方法制樣，HPLC檢測(cè)，計(jì)算血漿和肌肉中OTC的回收率。對(duì)上述樣品在1 d內(nèi)分5次進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每次重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日間精密度。

1.8數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Excel和SPSS10.0以及PKS藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.9休藥期計(jì)算

OTC在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)是按一級(jí)動(dòng)力學(xué)消除的，即在消除后期服從指數(shù)消除：C=C0e-Ket。休藥期的計(jì)算公式為：

其中WDT——休藥期，h；C0——?dú)埩粝雽?duì)數(shù)曲線的縱截距，μg/kg；MRL——最高殘留限量，μg/kg；Ke——?dú)埩粝€速率常數(shù)。

2　結(jié)果

2.1色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

在本試驗(yàn)的色譜條件下，OTC標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間都在6.8 min左右(圖1)。樣品中雖有雜峰出現(xiàn)，但與目標(biāo)峰分離度好。在0.010～2.500 μg/mL(μg/g)線性范圍內(nèi)，奧尼羅非魚(yú)血漿和肌肉中OTC的回歸方程分別為y=434.34x+0.592 7(R2=0.999 7)和y=372.71x-0.042 6(R2=0.999 4)。

2.2回收率和精密度

以信噪比(S/N)為3計(jì)，本方法測(cè)定OTC的最低檢測(cè)限為10 ng/mL(ng/g)。按照1.5的方法，測(cè)得血漿和肌肉中3個(gè)濃度的平均回收率為71.5%～96.5%，精密度為0.30%～5.88%，具體見(jiàn)表1。

表1　OTC在奧尼羅非魚(yú)血漿和肌肉中的回收率和精密度(n=5)Tab.1　Recoveries and precision of OTC in plasma and muscle of hybrid tilapia(n=5)

2.3藥代動(dòng)力學(xué)

奧尼羅非魚(yú)以15 mg/kg的劑量經(jīng)單次口灌OTC后，血藥濃度在7 h達(dá)到最高值(1.868±0.149)μg/mL；給藥后720 h無(wú)藥物檢出。經(jīng)PKS藥動(dòng)學(xué)軟件分析得OTC在血漿中的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)如表2所示，經(jīng)房室模型分析，表明OTC口灌給藥后在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的代謝符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，其血藥濃度(C)與時(shí)間(t)的理論方程為：C=-25.078e-0.169t+24.722e-0.145t+0.356e-0.015t，平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

表2　OTC在奧尼羅非魚(yú)血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2　Pharmacokinetic parameters of OTC in plasma of hybrid tilapia

2.4消除規(guī)律

奧尼羅非魚(yú)經(jīng)口灌OTC 7 h后，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)處理得到血漿和肌肉組織的消除曲線方程見(jiàn)表3，圖3、圖4為OTC在奧尼羅非魚(yú)血漿和肌肉中的擬合消除曲線，肌肉中的消除速率較快，血漿較慢。

表3　奧尼羅非魚(yú)口灌OTC后血漿和肌肉組織中的消除曲線方程及參數(shù)Tab.3　The equation of elimination curve and parameters of OTC in plasma and muscle tissue in hybrid tilapia

2.5休藥期

我國(guó)農(nóng)業(yè)部(1994)和世界糧農(nóng)組織(FAO，1991)規(guī)定OTC的MRL：魚(yú)肉中為0.1 mg/kg，通過(guò)休藥期公式計(jì)算得到的休藥期為9.24 d。在本試驗(yàn)條件下，建議OTC在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的休藥期不低于10 d。

3　討論

3.1OTC在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué)特征

本試驗(yàn)在單次口灌OTC(15 mg/kg)、水溫(25±2)℃條件下，所得血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，這與于相滿等[9]在單劑量水劑及混飼口灌OTC的代謝模型相似，同時(shí)也與其在草魚(yú)[10]、鰻鱺[11]、鱒[12]、鱸[13]等魚(yú)體內(nèi)的代謝模型相似，說(shuō)明OTC在大部分魚(yú)體內(nèi)的代謝模型相似。

本試驗(yàn)條件下，奧尼羅非魚(yú)的吸收半衰期為4.10 h，比于相滿等[9]口灌水劑和混飼的吸收半衰期(1.481 h、2.458 h)長(zhǎng)，這與其得出的結(jié)論，OTC易與飼料中的2價(jià)或3價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合影響其吸收[14]，飼料對(duì)魚(yú)體吸收OTC存在影響相符。本試驗(yàn)的吸收半衰期更長(zhǎng)，可能是因本試驗(yàn)為避免口灌后回吐現(xiàn)象較頻繁，而采用黏稠劑量的飼料進(jìn)行有關(guān)，說(shuō)明不同飼料對(duì)魚(yú)體吸收OTC可能存在不同影響。

此試驗(yàn)結(jié)果顯示，OTC在(25±2)℃水溫條件下的分布半衰期為4.79 h，分別比(21±1)℃下口灌水劑(24.834 h)和混飼的分布半衰期(12.193 h)[9]短，表明溫度對(duì)分布半衰期有明顯影響。于相滿等[9]試驗(yàn)結(jié)果顯示，將OTC加入飼料中口灌比口灌水劑的分布半衰期快1倍，本試驗(yàn)所得結(jié)果與其趨勢(shì)相同，進(jìn)一步驗(yàn)證飼料對(duì)OTC分布具有一定的影響作用。

OTC在本試驗(yàn)條件下的消除半衰期為45.20 h，分別比在(21±1)℃下口灌水劑60.312 h和混飼的消除半衰期(51.533 h)[9]短，這與消除半衰期受溫度影響，水溫越低半衰期越長(zhǎng)的結(jié)果一致。

由上可見(jiàn)，本試驗(yàn)所得結(jié)果與于相滿等[9]所得結(jié)果趨勢(shì)一致，說(shuō)明同種藥物的藥動(dòng)學(xué)特征受動(dòng)物的種屬、給藥方式和試驗(yàn)溫度影響較大，而受給藥劑量、動(dòng)物規(guī)格等因素影響較小。

3.2OTC在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的殘留消除特征

OTC進(jìn)入羅非魚(yú)體內(nèi)后，在魚(yú)體內(nèi)的分布較廣泛，且在肌肉組織中的濃度相對(duì)較高，表明OTC可用于治療羅非魚(yú)全身性感染。由擬合消除曲線可以看出OTC消除速度較慢，這可能是由于OTC屬于大環(huán)類抗菌藥物，易與Ca2+、Mg2+等離子絡(luò)合，結(jié)合產(chǎn)物不容易穿過(guò)細(xì)胞脂膜[15]。

在此研究試驗(yàn)條件[(25±2)℃水溫]下，OTC在奧尼羅非魚(yú)肌肉中的休藥期為10 d。徐維海等[16]在27～29℃的水溫條件下，研究四環(huán)素和OTC在吉富羅非魚(yú)體內(nèi)的消除，也是在9 d后殘留量低于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最大殘留限量0.1 mg/kg。李雪梅等[17]在(10±1)℃水溫條件下，OTC在魚(yú)肉中的含量在給藥后的第12天后才能低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留量。鄭增忍等[18]在16℃水溫條件下，OTC在大菱鲆肌肉中的休藥期為28 d。這說(shuō)明動(dòng)物種屬對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的休藥期影響較大。

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Pharmacokinetics and residues of Oxytetracycline hydrochloride in hybrid tilapia(Oreochromis aureus×O.niloticus)

LIAO Bichai

(Fujian Fishery Technical Extension Center，F(xiàn)uzhou 350002，China)

In order to study the metabolism and elimination of Oxytetracycline hydrochloride(OTC)in hybrid tilapia(Oreochromisaureus×O.niloticus)，single oral administration at dose of 15 mg/kg of OTC has been investigated in healthy hybrid tilapias at (25±2)℃.The result demonstrated that plasma concentration-time data of OTC were best fitted using a two-compartmental open model.Absorption，distribution and elimination half-life were 4.79，4.10 and 45.20 h，respectively.The maximal plasma concentration was 1.50 μg/mL，peaking at 7.30 h.Area under the plasma drug concentration-time curve was 42.35 μg·h/mL.As an edible tissue，muscle was selected as target tissue in this experiment.The maximum residue limit(MRL)is 0.1 mg/kg in muscle，the withdrawal time(WDT) should not be less than 10 days under this experiment condition.

Oxytetracycline hydrochloride；hybrid tilapia；pharmacokinetics；residues

2016-02-16

國(guó)家羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗(yàn)站(nycyfx-48-14).

廖碧釵(1982-)，女，福建古田人，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控工作及水產(chǎn)品質(zhì)量安全研究.Tel：0591-87878928.E-mail：liaobichai@163.com

S859.84

A

1006-5601(2016)02-0089-07

廖碧釵.鹽酸土霉素在奧尼羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(2)：89-95.