宋天宇，趙鵬，余濤,2，蔣輝,2（、防化研究院；2、國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 02205）

枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建

宋天宇1，趙鵬，余濤1,2，蔣輝1,2
（1、防化研究院；2、國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205）

摘要：枯草芽胞桿菌芽胞展示系統(tǒng)具有穩(wěn)定性高、安全性好、易收集純化等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于疫苗和藥物的制備、酶類及其他功能蛋白的生產(chǎn)等領(lǐng)域，同時(shí)其在生化戰(zhàn)劑的檢測、洗消、生物修復(fù)等方面也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以綠色熒光蛋白為模型蛋白，以CotG和CotZ為錨定蛋白，構(gòu)建枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)，并成功將綠色熒光蛋白展示在枯草芽胞桿菌的芽胞表面，為今后獲得可在復(fù)雜條件下發(fā)揮生物活性、貯存穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低的功能芽胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枯草芽胞桿菌；芽胞；表面展示；綠色熒光蛋白

1　前言

枯草芽胞桿菌芽胞表面展示技術(shù)是通過基因重組將外源蛋白與芽胞的錨定蛋白基因進(jìn)行基因融合，在芽胞形成過程中衣殼蛋白攜帶融合表達(dá)的外源蛋白組裝在芽胞表面，使其發(fā)揮特定的生物活性。枯草芽胞桿菌由于安全性好、遺傳操作體系完善的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，而枯草芽胞桿菌芽胞優(yōu)良的抗逆性使其成為一種理想的表面展示載體，保證了外源蛋白在復(fù)雜環(huán)境下的保存、運(yùn)輸和生物活性［1， 2］。

枯草芽胞桿菌芽胞含有70多種衣殼蛋白，其中以CotG作為錨定蛋白已成功展示了β-半乳糖苷酶、植酸酶、N-乙基神經(jīng)氨酸醛縮酶、α淀粉酶等多種酶類［3，5］，在酶制劑生產(chǎn)方面已顯示出良好的應(yīng)用前景，對生化戰(zhàn)劑的檢測、洗消、生物修復(fù)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用具有重要意義。近幾年，在枯草芽胞桿菌芽胞外殼層（crust）中還發(fā)現(xiàn)了新的衣殼蛋白CotZ，CotZ在芽胞的定位相比于傳統(tǒng)錨定蛋白更接近于芽胞表面，其特征有利于提高外源蛋白在芽胞表面展示的效率［6，7］。因此，以CotG和CotZ為錨定蛋白的枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)具有良好的開發(fā)潛力。

目前人們對于芽胞結(jié)構(gòu)和其組裝機(jī)制的了解尚不全面深入，芽胞表面展示系統(tǒng)能否成功構(gòu)建出具有較高生物活性的重組芽胞仍需要實(shí)驗(yàn)條件的摸索與探討。檢驗(yàn)芽胞表面展示系統(tǒng)能否有效展示外源蛋白是開展后續(xù)工作的基礎(chǔ)，現(xiàn)如今通過綠色熒光蛋白（green fl uorescent protein， GFP）及其突變體已被廣泛應(yīng)用于驗(yàn)證枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)［4， 5， 8，10］。本研究利用GFP為模型蛋白，以CotG和CotZ為錨定蛋白構(gòu)建枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)，用以驗(yàn)證芽胞表面展示系統(tǒng)的有效性，為今后獲得可在復(fù)雜條件下發(fā)揮生物活性、貯存穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低的功能芽胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。

2　材料和方法

2.1材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料

表達(dá)載體pET32a+購自 Novagen公司，表達(dá)載體pHY300PLK購自TaKaRa公司，克隆菌株Escherichia coli DH5α和表達(dá)菌株E. coli BL21購自TIANGEN公司，表達(dá)菌株Bacillus subtilis DB104由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第十研究所惠贈。本實(shí)驗(yàn)所使用的引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

2.1.2試劑

高保真DNA聚合酶、dNTP Mix、PCR Master Mix、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、HindIII、T4 DNA 連接酶均購自Thermo Fisher Scientific公司，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司，其他常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

2.1.3儀器

PCR儀（ABI 2720），恒溫?fù)u床（Infors Novotron），電轉(zhuǎn)儀（Bio-Red Micropulser），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc 2000），紫外分光光度計(jì)（日立U-2001），熒光光度計(jì)（日立F-2500）。

2.1.4培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/ L（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）；枯草芽胞桿菌感受態(tài)生長培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，山梨醇0.5mol/L；枯草芽胞桿菌電擊恢復(fù)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，山梨醇0.5mol/L，甘露醇0.3mol/L；DSM生胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯8 g/L，氯化鉀1 g/L，硫酸鎂1M，氯化錳10mM，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，蒸餾水定容至1L，滅菌后加入硝酸鈣至1M，硫酸鐵至1mM。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)gfp的基因序列，同時(shí)考慮載體pET32a+上多克隆位點(diǎn)、閱讀框及啟動子的作用方向，設(shè)計(jì)了一對特異性引物。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1　GFP基因PCR擴(kuò)增所需的引物序列

以攜帶gfp基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI對擴(kuò)增的基因和表達(dá)載體pET32a+進(jìn)行雙酶切，通過DNA連接反應(yīng)將gfp基因重組于載體pET32a+，命名為pET32a+-gfp。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pET32a+-gfp導(dǎo)入克隆菌株E. coli DH5α，以含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切和基因測序。鑒定基因準(zhǔn)確無誤后，提取重組質(zhì)粒pET32a+-gfp，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3），以含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

以枯草芽胞桿菌DB104基因組為模板，利用引物cotG-1 和cotG-2通過PCR擴(kuò)增衣殼蛋白cotG及其自身啟動子基因，并在CotG蛋白C端引入一段靈活肽鏈Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（表2加粗標(biāo)示）。使用限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI對擴(kuò)增的基因和穿梭載體pHY300PLK進(jìn)行雙酶切，并通過DNA連接反應(yīng)將擴(kuò)增的基因與載體pHY300PLK重組，命名為pHY300PLK-cotG。以質(zhì)粒pET21a+-gfp為模板，利用引物gfp-G1和gfp-G2擴(kuò)增gfp基因。使用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII對gfp基因和重組載體pHY300PLK-cotG進(jìn)行雙酶切，并通過連接反應(yīng)獲得重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG-gfp。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG-gfp導(dǎo)入克隆菌株E. coli DH5α，以含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切和測序鑒定。

以相同的方法構(gòu)建重組載體pHY300PLK-cotZ-gfp。由于cotZ基因自身的序列特性，在PCR擴(kuò)增時(shí)常發(fā)生非特異擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中通過兩對引物對cotZ基因進(jìn)行巢式PCR以獲取目標(biāo)基因。首先以枯草芽胞桿菌DB104基因組為模板，利用引物cotG-1和cotG-2擴(kuò)增包含衣殼蛋白cotZ及其自身啟動子的較長基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物通過切膠回收后作為第二次PCR的模板，再使用引物cotZ-3、cotZ-4擴(kuò)增衣殼蛋白cotZ及其自身啟動子基因，并在CotZ蛋白C端引入肽鏈。兩次PCR反應(yīng)的條件均為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。構(gòu)建重組載體的后續(xù)操作與CotG一致。

表2　錨定蛋白和GFP基因PCR擴(kuò)增所需的引物序列

2.2.2枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化

使用Gang-Ping， Xue電轉(zhuǎn)化法將重組載體pHY300PLK-cotG、pHY300PLK-cotG-gfp、pHY300PLK-cotZ、pHY300PLK-cotZ-gfp導(dǎo)入B. subtilis DB104感受態(tài)細(xì)胞（電轉(zhuǎn)條件：2.5kv，5ms，電擊1次）［11］，在含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)板上篩選重組菌株并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2.2.3綠色熒光蛋白樣品的制備

以上述構(gòu)建的GFP表達(dá)菌株pET32a+-gfp/BL21制備GFP樣品。將菌株以1:100接種于5ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、250r/min震蕩培養(yǎng)過夜，次日以1:100轉(zhuǎn)接種于200ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、250r/min震蕩培養(yǎng)3h，加入1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，15℃、250r/min震蕩培養(yǎng)16h。15000r/min離心集菌，重懸于10ml PBS緩沖液，超聲破碎細(xì)胞，15000r/min離心取上清，以0.45μl PVDF膜過濾，并以組氨酸柱純化。取10μl GFP純化液稀釋于4ml PBS緩沖液，即為GFP標(biāo)準(zhǔn)樣品。

2.2.4重組芽胞的制備

將重組菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104、pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104按1:100轉(zhuǎn)接于DSM培養(yǎng)基，通過營養(yǎng)匱乏法誘導(dǎo)芽胞形成，37℃、250r/min震蕩培養(yǎng)48h。取10μl生胞培養(yǎng)后的菌液，以滅菌水稀釋106倍，混勻后以200μl涂布于含有四環(huán)素的LB篩選平板，重復(fù)3組，37℃過夜培養(yǎng)，次日統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)；另取10μl生胞培養(yǎng)后的菌液80℃孵育15min，以滅菌水稀釋106倍，混勻后以200μl涂布于含有四環(huán)素的LB篩選平板，重復(fù)3組，37℃過夜培養(yǎng)，次日統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。未經(jīng)高溫處理的培養(yǎng)稀釋液克隆數(shù)乘5×106即為培養(yǎng)液全菌濃度（cfu/ ml），經(jīng)高溫處理的培養(yǎng)稀釋液克隆數(shù)乘5×106為芽胞濃度（cfu/ml），其比值為培養(yǎng)液的芽胞生成率［12］。以15000r/min離心收集培養(yǎng)液中的菌體，以2mg/ml溶菌酶溶液重懸后37℃孵育30min，15000r/min離心集菌，分別使用1M NaCl和1M KCl洗滌一次，再次以15000r/min離心集菌，使用純水洗滌2次［13］。以10ml無菌水重懸，65℃孵育1h［14］。15000r/min離心收集芽胞，重懸于10ml PBS緩沖液。

2.2.5重組芽胞的熒光鑒定

通過紫外分光光度計(jì)檢測上述芽胞懸液的OD600值，并以PBS緩沖液稀釋至OD600=0.1。使用熒光光度計(jì)檢測GFP樣品熒光強(qiáng)度并繪制其標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜（參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長為470nm，發(fā)射波長選取480至680nm）。在相同條件下測定稀釋后芽胞懸液的熒光強(qiáng)度，以相同基因型未生胞菌液和B. subtilis DB104芽胞懸液作為對照，每組檢測三次取平均值。

隨后以流式細(xì)胞分析分別檢測各芽胞懸液及其對照組，重復(fù)3組，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

3　結(jié)果與討論

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1綠色熒光蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

首先，構(gòu)建gfp基因重組載體，獲得重組質(zhì)粒pET32a+-gfp（圖1）。

圖1　GFP誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用EcoRI、XhoI對重組質(zhì)粒pET32a+-gfp進(jìn)行雙酶切，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。核酸電泳結(jié)果（圖2）顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切后在717bp處有明顯條帶，與gfp基因大小一致，表明我們獲得了正確的pET32a+-gfp基因重組質(zhì)粒。同時(shí)對重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，結(jié)果表明重組載體的gfp基因序列完全正確，未產(chǎn)生任何突變，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2　重組質(zhì)粒pET32a+-gfp的酶切鑒定M：1kb DNA Ladder；1：重組質(zhì)粒pET32a+-gfp的EcoRI和XhoI雙酶切鑒定。

其次，構(gòu)建GFP重組表達(dá)菌株pET32a+-gfp/BL21 （DE3）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎和純化，獲得GFP標(biāo)準(zhǔn)品（圖3）。取GFP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖4），結(jié)果顯示重組菌株pET32a+-gfp/BL21（DE3）全蛋白經(jīng)純化后，其在約45kDa處有一條明顯的條帶，大小與GFP一致，表明我們成功獲得了GFP重組表達(dá)菌株。

圖3　GFP標(biāo)準(zhǔn)品

圖4　GFP標(biāo)準(zhǔn)品的SDS-PAGE電泳圖M：PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder；1：GFP標(biāo)準(zhǔn)品

最后，對GFP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光檢測，以便得到GFP標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜。由光譜圖可知GFP在508nm處具有一個(gè)熒光發(fā)射峰（圖5），與文獻(xiàn)相符（由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境及儀器的不同會產(chǎn)生小幅度的偏移）[15]，表明我們成功的得到了GFP標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜。

圖5　GFP的標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜

3.1.2綠色熒光蛋白的芽胞表面展示

為保證衣殼蛋白CotG與外源蛋白GFP能夠在正確的時(shí)機(jī)表達(dá)并裝配于芽胞表面，本研究使用了CotG自身的啟動子對重組蛋白進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。通過PCR的方法直接將衣殼蛋白及其啟動子完整的擴(kuò)增出來，以枯草芽胞桿菌DB104基因組為模板，利用引物cotG-1和cotG-2擴(kuò)增出一段1039bp的基因序列，其3＇端的585bp為cotG編碼序列，5＇端的454bp是cotG啟動子序列［8］。

通過文獻(xiàn)報(bào)道，在錨定蛋白與展示的外源蛋白之間加入一段合適的連接肽鏈能夠減少表達(dá)裝配過程中的相互影響［16，17］。本研究通過在CotG基因3＇端添加能夠編碼氨基酸Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的基因序列（表2加粗標(biāo)示），從而在CotG蛋白C端引入一段被廣泛應(yīng)用的靈活肽鏈［8］，以提高外源蛋白GFP展示的成功率。

構(gòu)建gfp基因重組載體，獲得重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG-gfp（圖6a）和重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ-gfp（圖6b）。由于cotZ基因自身的序列特性，在PCR擴(kuò)增時(shí)常發(fā)生非特異擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中使用cotZ-1、cotZ-2和cotZ-3、cotZ-4兩對引物對cotZ基因進(jìn)行巢式PCR以獲取目標(biāo)基因。

圖6　GFP芽胞展示重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用EcoRI、BamHI對重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG進(jìn)行單、雙酶切，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果（圖7）顯示，經(jīng)EcoRI單酶切后重組質(zhì)粒在6637bp處有明顯條帶，與重組質(zhì)粒大小一致；經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切后在1039bp處有明顯條帶，與cotG及其啟動子基因大小一致，表明我們得到了正確的重組pHY300PLK-cotG質(zhì)粒。使用EcoRI、SmaI對重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ進(jìn)行單、雙酶切，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。核酸電泳結(jié)果（見圖7）顯示，經(jīng)EcoRI單酶切后重組質(zhì)粒在6510bp處有明顯條帶，與重組質(zhì)粒大小一致；經(jīng)EcoRI、SmaI雙酶切后在886bp處有明顯條帶，與cotZ及其啟動子基因大小一致，表明們得到了正確的重組pHY300PLK-cotZ質(zhì)粒。對pHY300PLK-cotG、pHY300PLK-cotZ兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的基因序列完全正確，并且未產(chǎn)生任何基因突變，可用于后續(xù)研究。

圖7　攜帶錨定蛋白基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定M：1kb DNA Ladder；1：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG的EcoRI酶切鑒定；2：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG的EcoRI和BamHI酶切鑒定；3：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ的EcoRI酶切鑒定；4：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ的EcoRI和SmaI酶切鑒定

使用BamHI、HindIII對重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG-gfp進(jìn)行雙酶切，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。核酸電泳結(jié)果（圖8）顯示，經(jīng)EcoRI、SmaI雙酶切后在717bp處有明顯條帶，與gfp基因大小一致，表明我們得到了正確的重組pHY300PLK-cotG-gfp質(zhì)粒；使用SmaI、BamHI對重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ-gfp進(jìn)行雙酶切，以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。核酸電泳結(jié)果（圖8）顯示，經(jīng)SmaI、BamHI雙酶切后在717bp處有明顯條帶，與gfp基因大小相符，表明我們得到了正確的重組pHY300PLK-cotZ-gfp質(zhì)粒。對pHY300PLK-cotG-gfp、pHY300PLK-cotZ-gfp兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的基因序列完全正確，并且未產(chǎn)生任何基因突變，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖8　攜帶GFP基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定M：1kb DNA Ladder；1：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotG-gfp的BamHI和HindIII酶切鑒；2：重組質(zhì)粒pHY300PLK-cotZ-gfp的BamHI和SmaI酶切鑒定

重組載體pHY300PLK-cotG-gfp、pHY300PLK-cotZ-gfp分別以電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入枯草芽胞桿菌DB104感受態(tài)細(xì)胞。由于重組質(zhì)粒攜帶四環(huán)素抗性基因，實(shí)驗(yàn)中利用含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)板篩選重組菌株。將獲得的陽性菌株在DSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)并使用營養(yǎng)匱乏法誘導(dǎo)形成芽胞，以間接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)菌液中的總菌數(shù)，并通過80℃孵育15min對菌液中的營養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行滅活，以間接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)芽胞數(shù)量（圖9，克隆數(shù)見表3）。經(jīng)計(jì)算，菌株pHY300PLK-cotG/DB104、pHY300PLK-cotG-gfp/DB104、pHY300PLK-cotZ/DB104、pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104總菌數(shù)分別為（2.00 ± 0.12）×107cfu/ml、（2.38 ± 0.46）×107cfu/ml、（1.6 ± 0.27）×107cfu/ml、（3.71 ± 0.39）×107cfu/ml，芽胞數(shù)分別為（1.28 ± 0.17）×107cfu/ml、（1.6 ± 0.37）×107cfu/ml、（1.46 ± 0.24）×107cfu/ml、（2.13 ± 0.14）×107cfu/ml，芽胞生成率分別為（64.09 ±10.88）%、（67.24 ±10.24）%、（91.71 ±8.45）%、（58.05 ±10.30）%。由此表明，此培養(yǎng)方法能夠使重組菌株有效地形成芽胞。

圖9　表面展示的重組菌株計(jì)數(shù)平板

第一列：菌株pHY300PLK-cotG/DB104培養(yǎng)液總菌；第二列：菌株pHY300PLK-cotG/DB104培養(yǎng)液芽胞；第三列：菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104培養(yǎng)液總菌；第四列：菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104培養(yǎng)液芽胞；第五列：菌株pHY300PLK-cotZ/DB104培養(yǎng)液總菌；第六列：菌株pHY300PLK-cotZ/DB104培養(yǎng)液芽胞；第七列：菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104培養(yǎng)液總菌；第八列：菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104培養(yǎng)液芽胞

表3　表面展示重組菌株的菌落計(jì)數(shù)

對純化后的重組芽胞及相關(guān)對照樣品進(jìn)行熒光檢測，通過對比各光譜的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)：重組菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104的芽胞熒光強(qiáng)度相對于對照組pHY300PLK-cotG /DB104芽胞在490至580nm之間均有顯著的增強(qiáng)，并在508nm處達(dá)到最大值，其趨勢與GFP的標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜一致（圖10）。表明重組菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104能夠成功將具有生物活性的GFP展示在芽胞表面。但重組菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104的芽胞與對照組pHY300PLK-cotZ/DB104的芽胞相比，熒光強(qiáng)度無明顯變化，表明此系統(tǒng)并未成功展示具有生物活性的GFP。

圖10　展示綠色熒光蛋白芽胞的熒光光譜

通過流式細(xì)胞分析對純化后的重組芽胞及相關(guān)對照樣品進(jìn)行檢測（圖11），統(tǒng)計(jì)每組樣品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（表4）。對比各組的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)：重組菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104的芽胞熒光強(qiáng)度相對于對照組pHY300PLK-cotG/DB104芽胞、pHY300PLK-cotG-gfp/DB104營養(yǎng)細(xì)胞有顯著增強(qiáng)（P＜0.001，圖12）；重組菌株pHY300PLK -cotZ-gfp/DB104與其對照組之間無明顯差異（P＞0.05，圖12）。再一次證明重組菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104將GFP成功展示在芽胞表面，而菌株pHY300PLK-cotZ -gfp/DB104未成功展示具有生物活性的GFP。

圖11　展示綠色熒光蛋白芽胞的流式細(xì)胞分析a. 菌株pHY300PLK-cotG/DB104的芽胞；b. 菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104的芽胞；c. 菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104的營養(yǎng)細(xì)胞；d. 菌株pHY300PLK-cotZ/DB104的芽胞；e. 菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104的芽胞；f. 菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104的營養(yǎng)細(xì)胞

表4　流式細(xì)胞檢測的平均熒光強(qiáng)度

圖12　流式細(xì)胞檢測的平均熒光強(qiáng)度組1：菌株pHY300PLK-cotG/DB104芽胞；組2：菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104芽胞；組3：菌株pHY300PLK-cotG-gfp/DB104營養(yǎng)細(xì)胞；組4：菌株pHY300PLK-cotZ/DB104芽胞；組5：菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104芽胞；組6：菌株pHY300PLK-cotZ-gfp/DB104營養(yǎng)細(xì)胞

3.2討論

枯草芽胞桿菌芽胞表面展示技術(shù)能夠提高外源蛋白在低溫、干燥、有機(jī)試劑等復(fù)雜環(huán)境下的穩(wěn)定性，可應(yīng)用于大分子量、多聚體蛋白，具有廣闊的應(yīng)用前景［18-20］。但對于錨定蛋白在芽胞的準(zhǔn)確定位和組裝機(jī)制尚不清楚，利用不同宿主、載體、錨定蛋白構(gòu)建的芽胞表面展示系統(tǒng)能否高效地展示外源蛋白仍需通過一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Hinc等人的研究表明，與CotB和CotC相比，CotG是唯一能夠展示完整尿素蛋白A亞基的錨定蛋白，這對于發(fā)揮外源蛋白的生物活性具有重要意義［21］。Obuchowski等認(rèn)為CotZ在芽胞的定位相比于傳統(tǒng)錨定蛋白更接近于芽胞表面，其特征有利于提高外源蛋白在芽胞表面展示的效率［7］。因此，本研究以蛋白酶缺陷型枯草芽胞桿菌DB104為宿主，分別構(gòu)建了以CotG和CotZ為錨定蛋白，以GFP為模型蛋白的枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)，其中以CotG為錨定蛋白的展示系統(tǒng)能夠成功將GFP展示在重組芽胞的表面并保持其自身的生物活性，為深入研究和應(yīng)用枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)展示不同的功能蛋白奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

重組芽胞的熒光強(qiáng)度與GFP在芽胞表面的展示效率相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以CotG為錨定蛋白的展示系統(tǒng)能夠在枯草芽胞桿菌的芽胞表面展示GFP蛋白，同時(shí)可以很好的保持GFP蛋白的生物活性。與已報(bào)道的相關(guān)研究進(jìn)行比較［8］，盡管所使用模型蛋白和表達(dá)載體有所不同，所獲得的重組芽胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果基本一致，表明本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的以CotG為錨定蛋白的芽胞表面展示系統(tǒng)具有良好的開發(fā)潛力。另外，本芽胞表面系統(tǒng)中使用了游離型載體復(fù)制和表達(dá)cotG基因，并未對宿主染色體上的cotG基因進(jìn)行敲除等處理。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在芽胞形成過程中cotG等位基因之間可能會產(chǎn)生競爭性表達(dá)，從而對外源蛋白的表達(dá)及展示效率產(chǎn)生影響［21， 22］，我們將對其進(jìn)行深入研究，以其進(jìn)一步提高外源蛋白的展示效率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，以CotZ為錨定蛋白的芽胞表面展示系統(tǒng)表達(dá)的重組芽胞熒光強(qiáng)度與對照組芽胞相比沒有明顯變化，說明CotZ的芽胞表面展示系統(tǒng)未能將GFP展示在芽胞表面或GFP在芽胞表面展示過程中喪失了自身的生物活性。與通過CotZ成功展示外源蛋白的研究比較后發(fā)現(xiàn)，其系統(tǒng)中均未使用連接肽鏈［7，16］。由此推測，以CotZ為錨定蛋白的展示系統(tǒng)失敗的原因可能是連接肽鏈對錨定蛋白CotZ與外源蛋白GFP在表達(dá)或組裝過程中產(chǎn)生了一定的干擾，其具體的原因有待進(jìn)一步的研究。探究是否由于連接肽鏈的引入導(dǎo)致GFP未能以具有生物活性的形式展示在芽胞表面將是后續(xù)工作的研究內(nèi)容。此外，本實(shí)驗(yàn)中芽胞表面展示系統(tǒng)使用的連接肽鏈Gl-Gly-Gly-Gly-Ser不含二級結(jié)構(gòu)，主要編碼空間位阻較小、不易帶點(diǎn)電的甘氨酸。這種結(jié)構(gòu)能增加融合蛋白之間的距離，在一定程度上減小相互干擾，同時(shí)其對于融合蛋白構(gòu)象的影響較小。而Hinc等研究發(fā)現(xiàn)在連接肽鏈中引入一段能夠形成穩(wěn)定α螺旋的EAAAK序列可有效提高外源蛋白在重組芽胞中的表達(dá)量和展示效率［7］。因此，使用含有穩(wěn)定α螺旋結(jié)構(gòu)的肽鏈連接CotZ與GFP也是后續(xù)研究的方向之一。

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中圖分類號：Q81

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:[CLC Number] Q819[Document Code] A10.11967/2016140305 10.11967/2016140305

基金項(xiàng)目：?國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（SKLNBC2013-05）

作者簡介：宋天宇（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯幚韺W(xué)

通訊作者：蔣輝，（E-mail）jiangtide@sina.cn

Construction of Surface Display Systems Using Bacillus Subtilis Spores

Tianyu Song1， Peng Zhao， Tao Yu1， Hui Jiang1，2
（ 1、Research Institute of Chemical Defense； 2、State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian ）

Abstract:Bacillus subtilis spore display system has been widely used in the preparation of vaccines and drugs, in the production of enzymes and other functional proteins because of its high stability, good safety, easy collection and purification feature. Meanwhile, it also plays an important role in the detection, decontamination and bioremediation of warfare agents. In this paper, we used two different carrier proteins CotG and CotZ to construct Bacillus subtilis spore surface display systems for green fluorescent protein, which provide a technical basis to obtain function spores with biological activity and low production cost using in comple?conditions.

Key Words:Bacillus subtilis; Spore; Display; Green fluorescent protein