馬 莉，艾慶燕（延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000）

VEGF、KDR在精索靜脈曲張大鼠睪丸中的表達意義

馬 莉，艾慶燕
（延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000）

摘要：目的 研究VEGF及KDR在實驗性左側(cè)精索靜脈曲張4周組及8周組大鼠睪丸中的表達變化，探討它們與精索靜脈曲張（VC）的關系及VC致男性不育的病理生理學機制。方法建立大鼠實驗性左側(cè)精索靜脈曲張模型，于術(shù)后4周和8周取雙側(cè)睪丸，采用免疫組織化學SP法檢測VEGF、KDR在實驗組和對照組SD大鼠睪丸上的表達情況。結(jié)果 ELV 4周組大鼠兩側(cè)睪丸中VEGF蛋白表達均上調(diào)，8周組表達均下降；ELV4周組大鼠睪丸中KDR蛋白的表達與對照組比較顯著增強，而8周組比對照組和4周組均顯著降低。結(jié)論VEGF和KDR在睪丸中的表達明顯受到ELV進程的影響，說明它們在VC致男性不育中起到一定的作用。

關鍵詞：透射式；脈率；血氧飽和度；光電容積脈搏波

[CLC Number] R394.1; R318.16[Document Code] ADOI: 10.11967/2016140309

英國外科醫(yī)生BARFIELD 首先提出精索靜脈曲張（varicocele， VC ） 可造成男性不育，VC是導致男性不育的常見疾病，在男性不育癥中占很大比例。VC也是一種血管性疾病，以精索內(nèi)蔓狀靜脈叢呈不同程度擴張、伸長和迂曲為特點［1］。大量臨床和實驗證明，VC時某些細胞因子可造成睪丸損傷，以至于干擾了精子的發(fā)生和成熟而致不育。目前，關于VC 導致不育的細胞分子病理機制取得了很大進展，主要包括生精細胞凋亡異常和氧化應激［2］兩方面。筆者等前期有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（ vascular endothelialgrowth factor，VEGF） 及其受體2（KDR）可能參與了精子的發(fā)生和成熟的調(diào)控過程，但他們?nèi)绾握{(diào)控雄性生殖以及他們與VC不育的相關性還未完全闡明。故本研究通過建立青春期大鼠實驗性左側(cè)精索靜脈曲張（ experimental left varicocele， ELV ）模型，采用免疫組化技術(shù)檢測VEGF和KDR蛋白在ELV4周和8周組睪丸中的表達變化，探討VEGF和KDR與精子發(fā)生的關系以及在VC 中的可能作用，為VC所致不育的可能機制的研究提供一些實驗資料。

1　材料與方法

1.1建模

購買SD 雄性大鼠40只，鼠齡大約6-7周，體重150-190 g（購買于北京芳元緣動物養(yǎng)殖場）。將大鼠隨機分為兩組，然后分別建立ELV4周組和8周組，也設假手術(shù)組作為對照。

1.2處理標本

分別于術(shù)后4 周及8 周麻醉大鼠，剖腹取ELV組及對照組雙側(cè)睪丸組織（以左側(cè)精索靜脈比術(shù)前擴張2倍以上，且雙側(cè)腎臟大小相當為建模成功，除2只靜脈曲張不明顯外，其余皆建模成功）。所有標本經(jīng)新鮮配制的Bouin's液固定后常規(guī)石蠟包埋，切片4-5 μm。

1.3試劑、方法及結(jié)果的判定

兔抗鼠多克隆VEGF、KDR抗體、SP-9001染色試劑盒與DAB顯色液均購自于北京榮興生物技術(shù)有限公司。采用SP法進行免疫組化染色：組織標本脫臘至水后，修復抗原采用枸櫞酸緩沖液微波修復，3%雙氧水可以消除內(nèi)源性過氧化物酶，TritonX-100浸泡可以增加組織的可穿透性，其他步驟嚴格按照試劑盒說明進行。以0.01 mol/LpH（7.0-7.4）PBS液代替一抗作為陰性對照。用日本Olympus I71型顯微鏡下觀察，以細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機選取至少5個視野拍照，然后用圖像分析儀測量灰度值，比較各組灰度值差異，灰度值越低表示免疫反應陽性越強。

1.4統(tǒng)計分析

數(shù)值結(jié)果以Mean ±SD表示。運用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ one-way ANOVA），檢驗水準α = 0. 05。

2　結(jié)果

本研究采用青春期ELV大鼠模型，是目前國內(nèi)外公認的理想的疾病模型，建模成功后取睪丸組織，采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)VEGF和KDR蛋白在正常及ELV大鼠的睪丸組織中都有表達。VEGF與 KDR陽性表達均呈棕黃色顆粒，在對照組與實驗組睪丸生精上皮內(nèi)可見陽性產(chǎn)物。VEGF和KDR蛋白在正常大鼠睪丸中的定位可見筆者前期論文［3］，免疫組化顯示VEGF和KDR在實驗組大鼠睪丸中也有表達（如圖），但對其表達水平進行圖像分析顯示，ELV 4周組大鼠左（圖2）、右側(cè)睪丸中VEGF蛋白的表達水平與對照組（圖1）比較均顯著增加（p＜0.01，p＜0.01），左側(cè)組表達量顯著高于右側(cè)組（p＜0.01）；ELV8周組左（圖3）右側(cè)睪丸VEGF蛋白的表達量下降（p＜0.01，p＜0.01），8周組表達量顯著低于相應4周組（p＜0.01，p＜0.01）（表-1）。

免疫組化顯示KDR蛋白在ELV組大鼠睪丸中也有表達（圖5，6）。結(jié)果分析顯示，在ELV4周組大鼠左（圖5）、右側(cè)睪丸中KDR蛋白的表達與對照組（圖4）比較均顯著增加（p＜0.01，p＜0.01），左右兩側(cè)之間其表達量也有明顯差異（p<0.05）；ELV8周組（圖6）KDR蛋白的表達和4周相應組比較有明顯改變，且其表達量8周組均比相應4周組下降（p<0.01，p<0.01），左右組間未見差異（p>0.05）；和對照組比較未見差異（p>0.05）（表-1）。

統(tǒng)計分析表明，ELV4周組雙側(cè)睪丸中VEGF、KDR蛋白表達均上調(diào)，而ELV8周時兩蛋白表達水平又下降，充分說明隨著精索靜脈曲張進程的延長，VEGF及其受體2的表達發(fā)生顯著變化。提示可能隨著ELV時間的延長，曲張對睪丸間質(zhì)細胞、支持細胞和生精細胞造成的結(jié)構(gòu)和功能的損害，使得VEGF與KDR蛋白合成與分泌的下降。說明ELV對睪丸的損害有累進性特點。

圖　VEGF和KDR在對照組、ELV4周及8周組大鼠左側(cè)睪丸上的免疫組化表達。標尺：50μ m。1,2,3:VEGF蛋白分別在對照組、ELV4周及8周組左側(cè)睪丸中的表達情況。4,5,6: KDR分別在對照組、ELV4周組、ELV8周組大鼠左側(cè)睪丸的陽性表達。Fig. Immunohistochemical expression of VEGF and KDR proteins in the left testis of the ELV rat, Scale: 50μ m.1,2,3: Expression of VEGF in the left testis of the control ,ELV4-and 8- week ELV groups,.4,5,6: KDR expression in the control,ELV4-week,ELV8-week groups testis.

表1　睪丸組織 VEGF、KDR免疫組化灰度值測定結(jié)果(Mean ±SD)Table 1. Immunohistochemistry image analysis results of VEGF and KDR proteins in the ELV testis (Mean ±SD)

3　討論

多年來，精索靜脈曲張（VC）被認為是導致育齡期男性不育的重要原因之一，發(fā)病大多在左側(cè)，其對生育力的影響越來越受到許多學者的重視，但其發(fā)病機理尚未完全闡明。近年來發(fā)現(xiàn)VC 不育患者存在細胞分子及遺傳學方面的異常，包括氧化應激[4]、基因多態(tài)性及細胞凋亡等[5]。還有學者認為青少年VC所致睪丸損傷與成人相似；并且對睪丸組織學損害具有累進性特點，與不育有相關性［6］。睪丸生精功能受神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，多種生長因子［7］以及性激素在生精細胞的分裂、增殖、分化等過程中起重要作用［8］。在已發(fā)現(xiàn)的3種VEGF受體中，受體2即KDR是血管發(fā)生和構(gòu)建的主要調(diào)節(jié)者，KDR與配體VEGF結(jié)合后介導內(nèi)皮細胞的增殖、分化等行為。VEGF 刺激內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通過結(jié)合和激活KDR 來實現(xiàn)。有研究表明［9］，受體1和2與VEGF的親和力不一樣，F(xiàn)lt-1與VEGF 的親和力比KDR與VEGF的親和力高，但酪氨酸酶活性卻比KDR低，所以Flt-1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的活性比KDR低，F(xiàn)lt-1對血管的生成可能具有負向調(diào)節(jié)作用。

本研究采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)VEGF和KDR蛋白在正常及ELV大鼠的睪丸組織中都有表達。對于ELV4周時兩蛋白上調(diào)，我們可以這樣解釋：首先，由于VC使睪丸組織內(nèi)呈現(xiàn)相對缺氧狀態(tài)，并使CO2、乳酸蓄積和PH 值改變，影響睪丸發(fā)揮正常功能。 因為VC時，大鼠睪丸處于低氧環(huán)境，促進了低氧誘導因子-1 （hypoxia inducible factor-1α ， H IF-1α）的表達，而H IF-1α可激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，VEGF即是其中的靶基因之一，可以導致VEGF-mRNA 持續(xù)和快速地增加，周可文等［10］也有研究發(fā)現(xiàn)VEGF 表達水平與HIF-1α呈同步性，說明VEGF在睪丸中可改善局部缺血缺氧環(huán)境，降低低氧對睪丸生精功能的負面影響。又由于VEGF可正向調(diào)節(jié)其受體1和2的表達，發(fā)揮生物學功能。因此，缺氧可能是兩種蛋白上調(diào)的原因之一。其次，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）也是H IF-1α的靶基因，在睪丸組織缺氧狀態(tài)下其活性增加，由于表達上調(diào)iNOS 的同時又促進了NO 合成增加，使得VEGF表達上調(diào)，改善VC 睪丸局部缺血缺氧狀態(tài)，但當局部NO 的濃度超過生理量時，則造成生精功能損傷［11］。其次，ELV4周時，我們發(fā)現(xiàn)睪丸細胞損傷較輕，在腺垂體分泌卵泡刺激素（FSH） 和黃體生成素（LH）的作用下，睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮作用增加，使血液中的睪酮升高［12，14］。眾所周知，睪酮（T）對男性生育能力起到關鍵的作用。另外，國外學者在03年發(fā)現(xiàn)，睪酮可正向調(diào)節(jié)VEGF的表達［13］，所以在ELV4周時睪酮水平增加的情況下，VEGF表達水平隨之上升。反過來說，VEGF與KDR結(jié)合后以自分泌和（或）旁分泌方式，作用于睪丸間質(zhì)細胞調(diào)節(jié)睪酮的合成以調(diào)節(jié)正常的生精過程。所以在ELV初期，VEGF表達水平的上升也促進了KDR表達水平的上升，兩者結(jié)合后誘導新生血管的形成，改善了精子發(fā)生的微環(huán)境，對ELV的睪丸功能起到積極的促進作用。

大量臨床和實驗資料證明，曲張組大鼠睪丸表現(xiàn)為睪丸萎縮，生精小管增厚［6］，超微結(jié)構(gòu)顯示間質(zhì)細胞凋亡、變性，胞質(zhì)內(nèi)有大量溶酶體顆粒；支持細胞間緊密連接普遍斷裂，胞質(zhì)內(nèi)線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體顆粒；精子細胞核畸形，核內(nèi)有大量空泡、核膜、頂體消失，染色質(zhì)濃縮成塊狀［14］。此外，國外學者Younes等研究證明，雄激素水平與ELV 的時程呈負相關［15］，隨著ELV時間的延長對睪丸性激素分泌的影響也可能是睪丸內(nèi)VEGF與KDR蛋白表達下調(diào)的因素之一。VC影響了睪丸性激素水平和精子發(fā)生的微環(huán)境，可能是引起不育的一個原因，雖然關于VC 的研究層出不窮，目前也已經(jīng)達到分子水平，但VC 致不育的確切機制仍不十分明了，而VEGF和KDR的表達變化提示在雄性生殖方面起著一定的積極作用。

4　結(jié)論

綜上所述，隨著ELV進程的增長，VEGF和KDR的表達發(fā)生先增加后減小的變化，它們表達水平的變化可能影響睪丸內(nèi)微環(huán)境的該變，從而間接改變精子發(fā)生、發(fā)育的過程，進而導致男性生育力的下降而導致不育，但是它們影響睪丸功能的具體機理、在精子發(fā)生和成熟中的具體作用、以及分子信號傳導機制還需進一步探索和研究。

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E-mail: mlx010305@163.com

中圖分類號：R394.1；R318.16

文獻標識碼：A

DOI：10.11967/2016140309

基金項目：?延安大學校級科研項目（YDQ2014-49）資助

作者簡介：馬莉（1983-），女，陜西靖邊縣人，碩士，講師。

Expression and Signifi cance of VEGF and KDR Proteins in the Testis of the ELV Rats

Li Ma， QingyanAi
（ Medical School of Yan'an University， Yan'an， Shanxi 716000， China ）

Abstract:Objective To study the expression changes of VEGF and KDR in the testis of experimental left varicocele 4-week and 8-week groups rats, Investigate the relative function of them and the pathological and physiological mechanism of male infertility caused by VC. Methods The testis were collected at 4 and8-week afterELV models of SD rats were established. Expression changes of the VEGF and KDR were detected by means of immunohistochemistry in the testis. Results Immunohistochemistry results showed The VEGF and KDR protein expression were up-regulated in 4-week groups compared with that of corresponding control groups , Expression ofVEGF and KDR protein were significantly decreased in 8 week groups compared with the control groups and 4-week groups. Conclusion The ELV procession affect the expression of VEGF and KDR protein in testis, which indicates that they may play an important role in male infertility caused by varicocele.

Key Words:VEGF; KDR; Experimental left varicocele ( ELV );Testis; Immunohistochemistry