林 霞，陳 崢，劉 波*，陳梅春，林恩泉

(1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院， 福建 福州 350002； 2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

植物內(nèi)生菌Endophytes指與植物達(dá)到共生、寄生、腐生等關(guān)系，且在植物的整個生命過程中無明顯負(fù)面影響的一類微生物[1]。內(nèi)生菌在植物中普遍地分布[2]，并幾乎存在于植物的所有組織中[3]。植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源，具有增加宿主對環(huán)境應(yīng)激耐受性、促進(jìn)宿主植物的生長和活性成分合成等作用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[2]。

紫蘇Perillafrutescens是我國傳統(tǒng)重要的藥用、食用和油料作物[4-5]，也是衛(wèi)生部首批公布的藥食兼用植物之一。該植物具有抑菌、抗敏和抗氧化等重要生物特性，廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、食品與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，紫蘇能防治感冒咳嗽，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫和抑制癌癥發(fā)生等功效[6-7]，在食品上用作天然防腐劑[8]等。目前關(guān)于紫蘇的有效成分、藥理、藥效的研究報道較多，對紫蘇內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌及其化學(xué)成分等[9-10]方面，如紫蘇內(nèi)生真菌Aspergillussp.12Y03[9]與Penicilliumsp.12Y25[10]。而國內(nèi)外尚少見有關(guān)紫蘇內(nèi)生細(xì)菌的報道。

為了解紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的多樣性和分布特性，本研究采用可培養(yǎng)法從紫蘇根、莖、葉中分離內(nèi)生芽胞桿菌，運(yùn)用16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，采用多樣性指數(shù)與聚類分析進(jìn)行統(tǒng)計，研究紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育，探討芽胞桿菌種類分布特征與宿主植物的相關(guān)性，為植物-微生物的相互作用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 新鮮健康的紫蘇于2022年3月采集自浙江衢州。采集時保持整棵植株的完整性，帶回實驗室后盡快處理。

1.1.2培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均采用LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的分離 內(nèi)生細(xì)菌的分離參考鄭榕等[11]的方法，紫蘇植株去除泥沙雜質(zhì)后，用無菌水沖洗后，分別稱取紫蘇根部、莖部和葉部各1 g，用75%乙醇與1%次氯酸鈉處理后，以無菌水沖洗3次，最后1次的沖洗液涂板檢驗植株表面是否消毒徹底。將漂洗后植物組織樣本研磨后取1 mL汁液，于超凈臺中將樣品用無菌水稀釋為原來的10-1濃度，在80℃的水浴鍋中加熱10 min后，稀釋至10-2、10-3、10-4，取不同濃度0.1 mL的樣品涂布在LB平板上，每個梯度重復(fù)3次，30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d。挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行劃線、純化、培養(yǎng)，獲得的單菌落用-80℃甘油冷凍保藏。

1.2.2紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增 芽胞桿菌的DNA提取采用酚氯仿法提取，采用16S rRNA基因通用引物27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 和1492R:5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序參照鄭雪芳等[12]的方法，PCR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

1.2.3紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌16S RRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的16S rRNA基因序列上傳至EzBioCloud，與已知模式菌株的序列進(jìn)行序列同源性比對，初步判斷菌株的分類地位。基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參考劉國紅等[13]的方法，運(yùn)用MEGA 7軟件分析序列，采用Neighbor-Joining方法推斷進(jìn)化史，進(jìn)化距離借助p-distance發(fā)進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇內(nèi)生細(xì)菌的分離

對紫蘇根、莖、葉中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離，根據(jù)菌落形態(tài)挑取單菌落進(jìn)行純化，共分離到內(nèi)生細(xì)菌19株，菌株編號見表1。從紫蘇根部中分離到的菌株數(shù)量最多，為11株(編號為FJAT-55199～55209)，從莖、葉中分離到的菌株數(shù)量較少，均為4株，莖部的內(nèi)生菌編號為FJAT-55210～55213，葉部內(nèi)生菌編號為FJAT-55214～55217。

表1 紫蘇不同組織樣本中分離的內(nèi)生細(xì)菌

2.2 紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的16S rRNA鑒定

分離到的19株內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因測序鑒定結(jié)果見表2，分離菌株歸屬于芽胞桿菌科Bacillaceae的4個屬，分別為虛構(gòu)芽胞桿菌屬Fictibacillus、芽胞桿菌屬Bacillus、普里斯特氏菌屬Priestia和Niallia。其中，虛構(gòu)芽胞桿菌屬Fictibacillus有2個種，為奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusenclensis；芽胞桿菌屬Bacillus有6個種，分別為高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides；Niallia有1個種，為環(huán)狀芽胞桿菌Nialliacirculans；普里斯特氏菌屬Priestia有2個種，為阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai、巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。

表2 基于16S rRNA基因的芽胞桿菌種類鑒定

2.3 紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

以19株紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌及13株同源菌株的16S rRNA序列為樣本，采用Neighbour-Joining方法，構(gòu)建紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果表明，紫蘇內(nèi)生菌主要分為A、B、C、D 4個類群。類群A主要包括了6株菌(FJAT-55200、FJAT-55204、FJAT-55205、FJAT-55207、FJAT-55208、FJAT-55216)，其中5株分離自根部，1株分離自葉部，與Niallia和普里斯特氏菌屬Priestia的親緣關(guān)系較近；類群B則包括3株菌(FJAT-55199、FJAT-55210、FJAT-55211)，分離自根部和莖部，與虛構(gòu)芽胞桿菌屬Fictibacillus的親緣關(guān)系較近，其中FJAT-55199、FJAT-55211與Fictibacillusbarbaricus聚為一類，而FJAT-55210與Fictibacillusenclensis聚為一類；類群C包括6株菌(FJAT-55201、FJAT-55202、FJAT-55206、FJAT-55209、FJAT-55212、FJAT-55214)，分離自根部、莖部和葉部；與芽胞桿菌屬的Bacillusaltitudinis、Bacillussafensis和Bacillusvelezensis親緣關(guān)系較近；類群D包括4株菌(FJAT-55203、FJAT-55213、FJAT-55215、FJAT-55217)，分離自根部、莖部和葉部，與芽胞桿菌屬的Bacilluscereus、Bacilluspseudomycoides和Bacillusparamycoides具有較近的親緣關(guān)系。

圖1 基于16S rRNA基因序列的內(nèi)生芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 紫蘇不同組織內(nèi)生芽胞桿菌的分布

由表3可知，芽胞桿菌在紫蘇的根、莖、葉中都有分布，呈現(xiàn)出種類和數(shù)量上的差異。7種內(nèi)生芽胞桿菌僅存在于植物單一組織中，如國化室虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusenclensis，只在莖中分離到；而副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides僅存在于葉部中，紫蘇則根部分布了較多獨(dú)特的芽胞桿菌種類，包括了貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、環(huán)狀芽胞桿菌Nialliacirculans和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。另外，有4種內(nèi)生芽胞桿菌在不同組織中同時被分離到，其中奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于根部和莖部，阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同時存在于根部和葉部，而沙福芽胞桿菌Bacillussafensis和蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus則同時存在于葉部和莖部。

表3 內(nèi)生芽胞桿菌在紫蘇植株中的分布

以芽胞桿菌在不同組織內(nèi)的分布種類為樣本，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化后進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖2。當(dāng)歐氏距離為3.63時，11種內(nèi)生芽胞桿菌可以分為3類。第1類包括5個菌：巨大普利斯特菌Priestiamegaterium、環(huán)狀芽胞桿菌Nialliacirculans、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis和貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis，5種芽胞桿菌均只分布在紫蘇的根部組織中；第2類包括2個菌：阿氏芽胞桿Priestiaaryabhattai和副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides，只存在于葉部組織中；第3類包括4個菌：分別為蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusenclensis，特征為在莖部組織內(nèi)分布，其中國化室虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusenclensis)單獨(dú)分布在植物的莖中，而奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于植物的根、莖中，蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis同時存在莖部和葉部中。

圖2 以種類為樣本的芽胞桿菌聚類分析

2.5 紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌的多樣性分析

利用表2為矩陣，以紫蘇不同組織為樣本，芽胞桿菌種類為指標(biāo)，對紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌多樣性進(jìn)行分析表明，紫蘇根部的Shannon多樣性指數(shù)(1.7987)均高于莖部(1.3863)和葉部(1.3863)，在豐富度方面，根部的豐富度(2.5022)也高于莖部(2.1640)和葉部(2.1640)。

表4 芽胞桿菌種類在紫蘇中的分布情況

3 討論

在農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，內(nèi)生菌能產(chǎn)生多樣的活性物質(zhì)，且與宿主植物關(guān)系密切，更有利于生防作用的發(fā)揮[14]，在植物病害生物防治中具有巨大應(yīng)用潛力[14-15]。芽胞桿菌是一類重要的植物內(nèi)生菌，廣泛地分布在多種植物的多個組織中[11]。本研究從紫蘇根、莖、葉中分離到的內(nèi)生菌，經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定，歸屬于芽胞桿菌科Bacillaceae的4個屬，11個種。紫蘇不同組織中含有豐富的內(nèi)生芽胞桿菌種類，包括了奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusenclensis、為高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides、環(huán)狀芽胞桿菌Nialliacirculans、阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。本研究探明紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌種類的同時，也豐富了植物組織內(nèi)部這種極端環(huán)境下的芽胞桿菌分布蹤跡。

植物內(nèi)生菌在宿主植物組織中的分布規(guī)律是內(nèi)生菌對外界適應(yīng)的重要機(jī)制，菌體及其代謝產(chǎn)物能對調(diào)控植株生長發(fā)育以及環(huán)境脅迫適應(yīng)等方面產(chǎn)生重要影響[16]。同時，細(xì)菌多樣性對揭示細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)功能及其與生存環(huán)境的相關(guān)性至關(guān)重要[13]。本研究分析了紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌在植物體內(nèi)的多樣性和分布特征。芽胞桿菌在紫蘇的根、莖、葉中都有分布，呈現(xiàn)出種類和數(shù)量上的差異。4種內(nèi)生芽胞桿菌在不同組織中同時存在，包括了奇異虛構(gòu)芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于根部和莖部；阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同時存在于根部和葉部；而沙福芽胞桿菌Bacillussafensis和蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus則同時存在于葉部和莖部，剩余的7種芽胞桿菌只存在于植物的單一組織中。在內(nèi)生菌分布多樣性方面，紫蘇根部的Shannon多樣性指數(shù)(1.798 7)均高于莖部(1.386 3)和葉部(1.386 3)，在豐富度方面，根部的豐富度(2.502 2)也高于莖(2.164 0)和葉(2.164 0)。鄭榕等[11]研究表明藥用植物夏枯草Prunellavulgaris根部組織內(nèi)生芽胞桿菌，在種類和數(shù)量都高于莖、葉部組織，芽胞桿菌在植株體內(nèi)的分布規(guī)律與本研究的結(jié)果相似。

藥用植物及其生境中的微生物關(guān)系密切，相互影響，相互作用，形成了植物-微生物共生體系，成為近來藥用植物研究熱點(diǎn)[17]。本文通過對紫蘇內(nèi)生菌的多樣性和分布特性分析，探明了紫蘇內(nèi)生芽胞桿菌資源，也為研究內(nèi)生芽胞桿菌與宿主植物的相關(guān)性提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。