王肇霖，陳睿毅，樓　寶，詹　煒，徐冬冬，王立改，劉　峰

（1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山　316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山　316021）

小黃魚(yú)精液超低溫冷凍保存技術(shù)的試驗(yàn)研究

王肇霖1，陳睿毅2，樓寶2，詹煒2，徐冬冬2，王立改1，劉峰1

（1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021）

摘要：為了研究小黃魚(yú)精液超低溫冷凍保存技術(shù)，分別比較了3種抗凍劑、3種降溫方法和2種復(fù)溫溫度對(duì)冷凍精液的影響。結(jié)果表明：采用Riger's液作為稀釋液、10%DMSO為抗凍劑，冷凍精液的激活率和受精率最高，與其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組差異顯著（P＜0.05），分別為92.36%和81.36%；以10℃/min的降溫速率將精液降至-80℃后液氮保存，40℃水浴解凍比室溫解凍可以獲得更好的受精效果，受精率和孵化率分別為78.47%和75.47%。

關(guān)鍵詞：小黃魚(yú)；精液；超低溫

小黃魚(yú)Larimichthys polyactis Bleeker，又名小鮮、黃花魚(yú)等，為石首魚(yú)科小黃魚(yú)屬魚(yú)類(lèi)，其廣泛分布于我國(guó)東海、黃海和渤海以及朝鮮半島西岸的近海海域，屬暖溫性近底層魚(yú)類(lèi)。自上世紀(jì)70年代以來(lái)，受過(guò)

1材料與方法

1.1小黃魚(yú)來(lái)源

2014年4月初，從寧波象山石浦港灣海域收集野生小黃魚(yú)1 000余尾，體長(zhǎng)約2 cm。用活水船轉(zhuǎn)移到浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行室內(nèi)車(chē)間養(yǎng)殖，餌料為魚(yú)寶牌配合飼料。2015年2月份開(kāi)始投喂牡蠣，并輔以VC和VE，至4月份性成熟，測(cè)量小黃魚(yú)平均體重為112±28 g，體長(zhǎng)4～5.5 cm。

1.2小黃魚(yú)精卵采集

將不同抗凍劑、降溫方式和復(fù)溫方式處理后的小黃魚(yú)精子分成若干組。設(shè)置受精率和孵化率兩個(gè)指標(biāo)來(lái)檢測(cè)不同組別冷凍保存精子的活力。采集小黃魚(yú)的卵子，與不同組別的精子進(jìn)行人工授精得到受精率和孵化率。2015年4月下旬，小黃魚(yú)性腺發(fā)育成熟，此時(shí)雄魚(yú)輕壓腹部即有精液流出，用不同方法進(jìn)行保存；挑選腹部膨大柔軟的雌性小黃魚(yú)進(jìn)行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)素為L(zhǎng)HRH-A2和HCG，劑量為1.2 μg/kg和500 IU/kg，催產(chǎn)36 h后即可人工取卵，置于潔凈干燥的燒杯中，冰盤(pán)避光保存，保存時(shí)間一般應(yīng)少于30 min。

1.3小黃魚(yú)精子抗凍劑的篩選

小黃魚(yú)精子冷凍保存液由精子稀釋液和抗凍劑組成，兩者的體積比為9∶1。精子稀釋液參考Riger's液的配方，略有改動(dòng)，見(jiàn)表1，抗凍劑選取甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）和丙二醇（EG）。將新鮮的小黃魚(yú)精液與精子冷凍保存液按1∶4的比例混勻，裝入1.5 mL的離心管中，4℃下靜置10 min后，以10℃/min的速度將溫度降至-80℃，平衡2 min后液氮中保存24 h，然后40℃水浴解凍，參考江世貴等［4］的方法計(jì)算精子激活率，然后進(jìn)行人工授精，計(jì)算受精率，鮮精作為對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)平行。

表1　小黃魚(yú)精子稀釋液成分表Tab.1　Larimichthys polyactis semen diluent ingredient

1.4降溫方式的篩選

用DMSO含量為10%的精子冷凍保存液按4∶1的比例稀釋小黃魚(yú)精液后，裝入1.5 mL的離心管中（每支裝1.0 mL），4℃下靜置10 min。按表2的方法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行降溫，液氮中保存24 h后，40℃水浴解凍，然后按精卵體積比1∶20的比例進(jìn)行人工授精，統(tǒng)計(jì)各組受精率和孵化率，設(shè)鮮精作為對(duì)照組，每組均3個(gè)平行。

表2　小黃魚(yú)精液降溫程序Tab.2　L.polyactis semen cooling process

1.5解凍方法的篩選

將小黃魚(yú)精液與10%DMSO的精子保存液按4∶1的比例混勻后，4℃下靜置10 min，然后以10℃/min的速度將溫度降至-80℃，平衡2 min后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行保存，24 h后分別在常溫（21℃）和40℃水浴下解凍，統(tǒng)計(jì)各組受精率和孵化率，每組均設(shè)3個(gè)平行。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

精子激活率是指精液與過(guò)濾海水混合后，于顯微鏡下觀(guān)察到的運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量與全部精子數(shù)量之比；受精率為囊胚個(gè)體數(shù)與受精卵總數(shù)之比；孵化率為出膜個(gè)體數(shù)與囊胚個(gè)體數(shù)之比，數(shù)據(jù)分析使用軟件SPSS19.0進(jìn)行，用單因素分析法對(duì)數(shù)據(jù)（Duncan氏多重比較）進(jìn)行差異顯著性比較。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1抗凍劑對(duì)精子激活率的影響

小黃魚(yú)鮮精與凍精的激活率與受精率結(jié)果見(jiàn)表3。在3種抗凍劑保存的凍精中，DMSO組的激活率和受精率最高，分別為92.36%和81.36%，EG和GLY次之。其中，10%DMSO保存的凍精組與鮮精對(duì)照組的激活率之間不存在顯著差異（P＞0.05），但與EG組和GLY組受精率存在顯著差異（P＜0.05）。而在受精率方面，DMSO組與EG組之間不存在顯著差異（P＞0.05），與鮮精組和GLY組存在顯著差異（P＜0.05）。

表3　小黃魚(yú)鮮精與凍精的激活率與受精率Tab.3　L.polyactis fresh essence and frozen activation rate and fertilization rate

2.2降溫方式對(duì)精子活力的影響

不同降溫方式對(duì)小黃魚(yú)受精率和孵化率的影響如圖1。從圖1可以看出，鮮精的受精率和孵化率最高，分別為78.65%和73.54%，Ⅲ組次之，Ⅱ組最低。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，Ⅲ組的受精率和孵化率最高，分別為均72.79%和61.83%，且與其他兩組存在顯著差異（P＜0.05），表明該種降溫方式對(duì)小黃魚(yú)精液的影響較小，以該種方式對(duì)小黃魚(yú)精液進(jìn)行冷凍保存較為合適。

2.3解凍溫度對(duì)精子活力的影響

在不同的溫度下對(duì)小黃魚(yú)冷凍精液進(jìn)行解凍，人工授精后，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，鮮精的受精率和孵化率最高，40℃水浴解凍組次之，分別為78.47%和75.47%，室溫解凍組最低，分別為72.56%和70.32%。40℃水浴解凍組和室溫解凍組之間存在顯著差異（P＜0.05），表明以-10℃/min的速度將精液溫度降至-80℃后投氮保存，使用時(shí)40℃水浴解凍對(duì)精子損傷較小，授精可獲得理想效果。

圖1　降溫方式對(duì)小黃魚(yú)精子活力的影響Fig.1　The influence of cooling way of Larimichthys polyactis sperm vitality

圖2　解凍方法對(duì)小黃魚(yú)精子活力的影響Fig.2　The influence of thawing method of L.polyactis sperm vitality

3討論

3.1抗凍劑的選擇

抗凍保護(hù)劑的選取是進(jìn)行精子超低溫冷凍保存過(guò)程中至關(guān)重要的部分，它可以在一定程度上抑制或降低降溫過(guò)程中水冰晶的形成，阻止水冰晶對(duì)于精子的機(jī)械損傷，從而達(dá)到抗凍的目的［2］。目前，常用的抗凍劑主要有甲醇（MeOH）、乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）和丙二醇（PG）等［3-4］。程順等［5］采用GLY作為抗凍劑對(duì)大黃魚(yú)精液進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)5%～20%GLY為抗凍劑，冷凍保存效果最佳，凍精活力與鮮精活力無(wú)顯著差異。魏平等［8］使用5%～25%的DMSO和10%～20%的EG為抗凍劑，超低溫凍存真鯛精子的效果較佳，凍精核DNA損傷較輕。參考大黃魚(yú)的相關(guān)研究［6］，本實(shí)驗(yàn)中將抗凍劑的比例設(shè)為10%，并選取了EG、GLY和DMSO 3種抗凍劑進(jìn)行抗凍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，相同的降溫和解凍方法下，10%DMSO抗凍效果最好，獲得了92.36%和81.36%的受精率和孵化率。相關(guān)研究表明［7］，DMSO是比較有效的魚(yú)類(lèi)精子冷凍抗凍劑，10%DMSO是一個(gè)高度有效的濃度，既能起到良好的抗凍作用，又不會(huì)因抗凍劑濃度過(guò)高而導(dǎo)致精子中毒，適合于多種魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存［8］。

3.2降溫方式的選擇

對(duì)于魚(yú)類(lèi)精子而言，魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存時(shí)所受的損傷主要在于冷凍和復(fù)蘇兩個(gè)步驟，而冰晶則是冷凍過(guò)程中的最大危害因素［9］。目前，魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存多采用分段降溫法，一種是以一定的降溫速率將精液降至某一臨界溫度，穩(wěn)定數(shù)分鐘后再投氮保存，如虹鱒Oncorhynchus mykiss［9］、尖吻鱸Lates calcarifer［9］和大黃魚(yú)［10］等；另一種是將精液停留在離液氮面某一高度數(shù)分鐘后投氮保存，如真鯛［5］、鮸魚(yú)［11］和黃姑魚(yú)［12］。本實(shí)驗(yàn)中，以-10℃/min的速率將精液降溫至-80℃，穩(wěn)定2 min后投氮保存，效果最佳，這一結(jié)果也與大黃魚(yú)的研究結(jié)果相似［9］。本實(shí)驗(yàn)采用的降溫方式有利于精子對(duì)低溫的適應(yīng)，能夠在凍結(jié)前充分脫水，減少冰晶形成，安全越過(guò)-15～-60℃這段危險(xiǎn)溫度區(qū)。當(dāng)然，由于魚(yú)的種類(lèi)、所用抗凍劑和稀釋液存在差異，每種魚(yú)的最適降溫速率也不應(yīng)一概而論，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

3.3解凍溫度的選擇

研究表明，冷凍精液的解凍溫度與降溫速率具有很大的相關(guān)性，較慢的降溫速率搭配較慢的解凍速率，可以獲得較好的解凍效果［9］。本實(shí)驗(yàn)中，采用10℃/min的速率進(jìn)行降溫，搭配40℃水浴下解凍效果最好，說(shuō)明，對(duì)于小黃魚(yú)而言，使用10℃/min的降溫速率和40℃解凍溫度對(duì)小黃魚(yú)精子損傷較小，可以獲得較為理想的受精率和孵化率。劉清華［13］對(duì)真鯛精子進(jìn)行冷凍研究發(fā)現(xiàn)，以20℃/min的降溫速率，40℃水浴解凍，受精率和孵化率最高；肖志忠等［10］以20℃/min的速率對(duì)大黃魚(yú)精子進(jìn)行超低溫保存43℃水浴解凍后，凍精和鮮精的受精率和孵化率相似。魚(yú)類(lèi)精液冷凍保存方法的選擇受多方面因素的影響，同時(shí)由于魚(yú)類(lèi)精子具有獨(dú)特的激活機(jī)制，還要加強(qiáng)對(duì)冷凍過(guò)程中線(xiàn)粒體的損傷機(jī)制及魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)分子機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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中圖分類(lèi)號(hào)：S961.2+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào):1008-830X（2016）01-0015-04

收稿日期：2015-12-23

基金項(xiàng)目：浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015F50006）；舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C31061）；象山縣科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C0014）

作者簡(jiǎn)介：王肇霖（1992-），女，江蘇南京人，碩士研究生，研究方向：魚(yú)類(lèi)遺傳育種.E-mail:s92922@sina.com

通訊作者：樓寶（1969-），男，浙江義烏人，教授，研究方向：海水魚(yú)類(lèi)繁殖及遺傳育種.E-mail:loubao6577@163.com度捕撈和環(huán)境惡化等因素的影響，小黃魚(yú)產(chǎn)量逐年減少，捕獲多為體重小于100 g的幼魚(yú)，開(kāi)展小黃魚(yú)精液冷凍保存技術(shù)的研究，將品質(zhì)優(yōu)良的小黃魚(yú)精液保存起來(lái)，可以為遺傳多樣性的保護(hù)提供技術(shù)支持，同時(shí)可以為遺傳育種、遠(yuǎn)緣雜交和隔代回交等研究提供材料［1］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究，如大黃魚(yú)Larimichthys crocea、斑鱖Siniperca scherzeri、真鯛Pagrosomus major精子等［2-3］。本文通過(guò)比較篩選抗凍劑的種類(lèi)、比例以及降溫和復(fù)溫方法對(duì)冷凍小黃魚(yú)受精率和孵化率的影響等進(jìn)行研究，以期得到最佳的小黃魚(yú)精子冷凍保存方法，為小黃魚(yú)的人工繁殖技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

The Study of Larimichthys polyactis Spermatozoa Cryopreservation

WANG Zhao-lin1，CHEN Rui-yi2，LOU Bao2，et al
（1.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022；2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan316021，China）

Abstract:In order to develop a method for spermatozoa cryopreservation of Larimichthys polyactis，we compared the effect of three different antifreeze，three different cooling methods and two thawing temperature on the frozen spermatozoa，respectively.The results showed that，the activation of frozen spermatozoa rate and fertilization rate were highest using the Riger's as diluent and 10%DMSO as antifreeze.The activation rate and fertilization rate are 92.36%and 81.36%respectively，which were significant higher than those in the other 2 experimental groups（P＜0.05）.The best cryopreservation were obtained at the rate of at the speed of 10℃/ min and then kept them in the liquid nitrogen for preservation.The better thawing effect of frozen sperm were got using the water bath at 40℃ than at room temperature.Using the water bath，the fertilization rate and hatching rate were 78.47%and 75.47%，respectively.

Key words：Larimichthys polyactis；spermatozoa；cryopreservation