張海天 王國(guó)祥 楊欣 邱滿(mǎn)堂 許林

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5（glypican-5, GPC5）在非小細(xì)胞肺癌中扮演著抑癌基因的角色，且GPC5在非小細(xì)胞肺癌組織中顯著低表達(dá)，而過(guò)表達(dá)GPC5可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[1]。此后，陸續(xù)有研究[2,3]報(bào)道GPC5在肺癌中低表達(dá)且具有抑癌基因樣作用。

目前的研究多認(rèn)為GPC5是一個(gè)轉(zhuǎn)移抑制因子，而GPC5對(duì)細(xì)胞增殖影響的研究較少；此外，GPC5的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。因此，在本研究中我們構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)GPC5的肺腺癌A549細(xì)胞株，通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段來(lái)研究GPC5對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力和基因表達(dá)的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；慢病毒載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株由上海吉?jiǎng)P生物公司完成；RNA提取試劑Trizol購(gòu)于Invitrogen公司。1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，Cell Counter Kit8（CCK8）和EdU試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞株A549在含10%FBS的1640培養(yǎng)液中，37oC、5%CO2保持飽和濕度培養(yǎng)，2天-3天傳代一次[4]。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種3,000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；分別在接種細(xì)胞貼壁后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK8試劑，孵育2 h后使用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光值[5]。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種200個(gè)細(xì)胞，每4天換液一次。2周后吸去培養(yǎng)基，使用甲醇將細(xì)胞克隆固定，然后用結(jié)晶紫染液染色，計(jì)數(shù)每個(gè)孔中克隆形成數(shù)目并拍照。

1.5 EdU實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻接種與蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后使用凱基EdU試劑盒進(jìn)行染色固定并拍照。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 GPC5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和空白對(duì)照的A549細(xì)胞由Trizol法提取RNA，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析由上海烈冰生物有限公司完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所用統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 1 相對(duì)于空白載體組，過(guò)表達(dá)GPC5顯著抑制了A549細(xì)胞的增殖速率（A），克隆形成數(shù)目也顯著減少（181±17 vs 278±23）（B）。EV：空載體組；GPC5：過(guò)表達(dá)GPC5組；*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 1 Compared with empty vector, overexpression of GPC5 significantly inhibited cell proliferation rate (A) and colony formation number (B). EV: empty vector; GPC5: overexpression of GPC5; *P＜0.05,**P＜0.01.

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)GPC5抑制A549細(xì)胞增殖速率和克隆形成能力相對(duì)于空白載體組，CCK8結(jié)果提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GPC5后，A549細(xì)胞的增殖速率被顯著抑制，且以接種后第三天后抑制效果最明顯（圖1A）。在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)GPC5后A549細(xì)胞形成的克隆數(shù)目顯著少于空白載體組（181±17vs278±23，圖1B），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖 2 相對(duì)于空白載體組，過(guò)表達(dá)GPC5組陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低。EV：空載體組；GPC5：過(guò)表達(dá)GPC5組。Fig 2 Compared with empty vector, overexpression of GPC5 decreased the percentage of positive staining cells. EV: empty vector; GPC5: overexpression of GPC5.

圖 3 過(guò)表達(dá)GPC5后，47個(gè)具有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖功能的基因顯著下調(diào)。EV：空載體組；GPC5：過(guò)表達(dá)GPC5組；綠色：下調(diào)基因；紅色：上調(diào)基因。Fig 3 Compared with empty vector, 47 genes of Gene Ontology item “positive regulation of cell proliferation”were downregulated. EV: empty vector, GPC5:overexpression of GPC5; green: downregulated genes;red: upregulated genes.

2.2 過(guò)表達(dá)GPC5抑制A549細(xì)胞增殖能力 如圖2所示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPC5之后，EdU染色陽(yáng)性的細(xì)胞比例顯著低于空白載體組。CCK8、平板克隆形成和EdU結(jié)果證實(shí)：過(guò)表達(dá)GPC5可以抑制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖能力。

2.3 過(guò)表達(dá)GPC5抑制增殖相關(guān)基因表達(dá) 為了研究過(guò)表達(dá)GPC5對(duì)A549細(xì)胞基因表達(dá)變化影響，我們將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPC5和空白載體組的A549進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPC5之后有876個(gè)基因表達(dá)顯著升高，而1,232個(gè)基因表達(dá)顯著降低。對(duì)下調(diào)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology, GO）分析發(fā)現(xiàn)具有“positive regulation of cell proliferation”功能的47個(gè)基因被顯著富集（圖3和表1）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和GO分析結(jié)果提示過(guò)表達(dá)GPC5可以下調(diào)具有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖功能基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖能力。

表 1 47個(gè)具有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖功能的基因Tab 1 47 downregulated genes of Gene Ontology item “positive regulation of cell proliferation”

3 討論

GPC5是一種細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，GPC5可以通過(guò)糖基-磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜表面。GPC5基因?qū)儆诹字＜〈嫉鞍拙厶牵╤eparan sulphate proteoglycans, HSPGs）家族，該家族有6個(gè)成員，分別為GPC1到GPC6[6,7]。HSPGs家族成員與多種腫瘤發(fā)生進(jìn)展相關(guān)，如GPC3在肝癌中顯著高表達(dá)[8]，而GPC1可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[9]。而目前對(duì)于GPC5與腫瘤的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)于GPC5發(fā)揮抑癌作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

本課題組已報(bào)道在肺癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)GPC5可以顯著抑制SK-MES1細(xì)胞的侵襲、遷移能力，在本研究中我們進(jìn)一步在肺腺癌細(xì)胞A549中探討GPC5對(duì)細(xì)胞增殖能力和基因表達(dá)的影響。通過(guò)CCK8、平板克隆和EdU實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了過(guò)表達(dá)GPC5可以顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖能力。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白載體組，過(guò)表達(dá)GPC5后，2,108個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GPC5之后，具有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基因顯著下調(diào)，例如CXCL5[12]、SOX4[11,12]。作為一個(gè)細(xì)胞膜蛋白，Li等[6]曾推測(cè)GPC5可能通過(guò)刺激或者抑制下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，如通過(guò)Wnt、hedgehog和FGF信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GPC5可以導(dǎo)致眾多基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，而其中的具體分子生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)GPC5可以顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力，而且過(guò)表達(dá)GPC5后具有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用的基因表達(dá)下調(diào)，具體的信號(hào)通路機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。