萬古霉素聯(lián)合阿奇霉素對形成生物被膜耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抗菌效果分析

黃麗

（安徽省銅陵市立醫(yī)院 檢驗科，安徽 銅陵 244000）

萬古霉素聯(lián)合阿奇霉素對形成生物被膜耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抗菌效果分析

黃麗

（安徽省銅陵市立醫(yī)院 檢驗科，安徽 銅陵 244000）

目的探討體外萬古霉素與阿奇霉素聯(lián)合應用對形成生物被膜的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（M R SA）的抗菌效果。方法使用頭孢西丁紙片擴散法和M R SA膠乳凝集實驗確定M R SA，采用剛果紅培養(yǎng)基判斷生物被膜的形成，通過肉湯稀釋法將萬古霉素和阿奇霉素進行棋盤格聯(lián)合藥敏試驗，測出不同濃度下的抑菌指數(shù)（F I C），據此判定兩藥聯(lián)用后所呈現(xiàn)出的相關效應。結果萬古霉素和阿奇霉素聯(lián)用組最小抑菌濃度（M I C）明顯低于各單藥組，兩藥聯(lián)用主要表現(xiàn)為相加作用（88.2%）和協(xié)同作用（11.8%），無無關作用和拮抗作用。相加作用時F I C為0.5～1.0；協(xié)同作用時F I C≤0.5。結論萬古霉素聯(lián)用阿奇霉素對生物被膜形成的M R SA具有明顯的體外抑菌效果，可以指導臨床有效地降低藥物使用劑量，減少毒副作用。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；棋盤格稀釋法；生物被膜；萬古霉素/阿奇霉素

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（M RS A）已成為臨床感染的主要病原菌，對大多數(shù)抗菌藥物耐藥。生物被膜（B F）的形成也是導致金黃色葡萄球菌多重耐藥的主要原因之一［1］。萬古霉素是治療M RS A的首選藥物，目前該藥物的使用濃度已經呈現(xiàn)高度飄移的現(xiàn)象。聯(lián)合使用現(xiàn)有的抗菌藥物治療臨床多重耐藥的細菌感染，能夠有效地降低藥物使用劑量、延緩細菌的耐藥性。國內已有阿奇霉素對細菌生物被膜的抑制干擾作用的報道，但聯(lián)合萬古霉素用于生物被膜形成的革蘭陽性球菌的報道較少見。本研究將萬古霉素與阿奇霉素在不同濃度下聯(lián)合使用，觀察所表現(xiàn)出的體外相關效應，為臨床上有效治療生物被膜形成的M RS A感染提供科學用藥的依據。

1　資料與方法

1.1菌株

選取2014年7月～2015年6月于銅陵市立醫(yī)院臨床分離的17株生物被膜形成的M RS A，無重復菌株。質控菌株金黃色葡萄球菌（A T CC25923，A T C C29213），表皮葡萄球菌A T CC12228均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑

M icro S can 40全自動微生物鑒定儀，M-H瓊脂、陽離子調整的M-H肉湯為英國O X O I D產品，M RS A膠乳凝集試劑購自梅里埃公司，藥敏紙片萬古霉素（V A N）、阿奇霉素（A Z M）、頭孢西?。‵ O X）均為英國O X O I D產品，剛果紅培養(yǎng)基為上海遠慕生物公司產品，棋盤格稀釋法使用的阿奇霉素和鹽酸去甲萬古霉素分別購自浙江亞太制藥公司和美國禮來公司。

1.3方法

1.3.1M R SA的檢出①頭孢西丁紙片法（C LS I）。以K-B紙片法進行篩選，金黃色葡萄球菌A T CC25923（敏感株）、A T CC29213（耐藥株）作為質控菌株，按照C LS I 2015版標準判讀抑菌圈結果：頭孢西丁抑菌圈≤21mm（M RS A），抑菌圈≥22mm（M SS A）。②乳膠凝集試驗。嚴格按照試劑說明書進行P B P2a提取。在2個試劑反應圈內分別加入含抗P B P2a單克隆抗體致敏的測試膠乳試劑1滴和陰性質控膠乳1滴，然后各滴加提取的上清液50μl，均勻地涂布整個反應圈，搖動反應3min后觀察凝集現(xiàn)象。判斷結果：測試乳膠反應圈內產生肉眼可見的凝集為P B P2a陽性（M RS A）；反應圈內勻質分布，均無凝集為P B P2a陰性（M SS A）。

1.3.2生物被膜形成株的檢出采用剛果紅培養(yǎng)基法篩選生物被膜菌株［2］，染液剛果紅可以與形成生物被膜的黏液膜、胞外多糖如黏附素（PI A）等因子發(fā)生產色反應［3］。將確定為M RS A的菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基，35℃、48 h后判斷結果。以金黃色葡萄球菌A T CC29213產生的菌落形態(tài)為標準［4］，菌落為黑色或有干燥結晶并且周圍培養(yǎng)基顏色淡化者判定為生物被膜形成陽性菌株，不變色者為生物被膜形成陰性。設表皮葡萄球菌A T CC12228為陰性對照組。

1.3.3棋盤格稀釋法聯(lián)合藥敏試驗①菌液制備。選取血平板純培養(yǎng)的新鮮菌落4、5個，M-H肉湯增菌6 h后，配制成0.5麥氏單位的菌懸液，并用肉湯稀釋成5×105C F U/ml的菌液備用；②藥物母液的配制。分別用無水乙醇和蒸餾水將阿奇霉素、萬古霉素配制成濃度為1 280μg/ml的母液，置入4℃冰箱保存?zhèn)溆?；③檢測時，先用M-H肉湯倍比稀釋備用的藥物母液，使母液的濃度遞減，依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.500、0.250、0.125和0.0625μg/ml。先檢測萬古霉素和阿奇霉素的單用最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC），然后確定各藥物2倍的MIC為該藥物的最高濃度［5］，將選擇好的6個稀釋度依次對倍稀釋。操作時，采取兩兩組合，將含有2種抗菌藥物不同濃度的混合液1ml分別加入36個試管中，各管加50μl，35℃溫育24 h后觀察結果。通過公式計算抑菌指數(shù)（F IC），依據標準判斷萬古霉素和阿奇霉素二者間的相關作用。

F IC計算與判斷標準：

判斷標準：協(xié)同作用F IC≤0.5；相加作用0.5＜F IC≤1；無關作用1＜F IC≤2；拮抗作用F IC＞2。

1.4統(tǒng)計學方法

采用S P SS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間數(shù)據比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1聯(lián)合藥敏結果

17株生物被膜形成的M RS A，萬古霉素及阿奇霉素聯(lián)合使用時的MIC比單獨用藥時降低，兩藥物之間相加作用為88.2%（0.5＜F IC≤1），協(xié)同作用為11.8%（F IC≤0.5），確定無無關作用和拮抗作用。見表1。

2.2萬古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用結果

萬古霉素與阿奇霉素單用及聯(lián)用的組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），萬古霉素聯(lián)用后MIC由單用時的1.21m g/L降至0.38m g/L，阿奇霉素聯(lián)用后MIC由單用時的60.24m g/L降至18.94m g/L，提示萬古霉素與阿奇霉素聯(lián)合使用時，對形成生物被膜的M RS A有較好的體外抗菌效果。見表2。

表1　萬古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用的M I C比較（m g/L）

表2　萬古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用M I C比較（m g/L，）

表2　萬古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用M I C比較（m g/L，）

組別阿奇霉素單用　1 . 2 1 ± 0 . 5 4 　6 0 . 2 4 ± 3 5 . 7 9聯(lián)用　0 . 3 8 ± 0 . 3 2 　1 8 . 9 4 ± 1 5 . 0 6 t值　8 . 5 0 　5 . 4 3 P值　0 . 0 0 1 　0 . 0 0 1萬古霉素

3　討論

M RS A的耐藥機制主要是由mec A基因介導表達為青霉素蛋白P B P2a，表現(xiàn)為低親和力，與β-內酰胺類藥物很少或不與之結合，故表現(xiàn)為耐藥。近年來還發(fā)現(xiàn)，mec A基因與輔助基因及表控基因的共同作用，明顯提高了M RS A對β-內酰胺類藥物的耐藥性［6］，并且表現(xiàn)出多重耐藥。

另外，對M RS A進行分子生物學觀察，證實M RS A的另一個重要特性是形成生物被膜。生物被膜是細菌的自我保護形式，由多聚復合物包裹菌體形成，天然的被膜屏障和膜內的特殊微環(huán)境阻礙或延緩抗生素進入菌體，從而提高細菌的自身耐藥性和免疫逃避性［7］。由生物被膜細菌導致的持續(xù)性和反復性的嚴重感染已被公認為是抗感染的最為棘手的難題［8］。

萬古霉素是糖肽類抗菌藥物的代表藥物，早已成為全世界治療M RS A引起的重癥感染的首選抗菌藥物［9］。如何合理地使用萬古霉素，并聯(lián)合其他抗菌藥物以應對由于萬古霉素MIC值的爬升所導致M RS A菌株對萬古霉素的敏感性下降［10］，最大限度地降低萬古霉素臨床使用中嚴重的毒副作用成為新的研究熱點。

大環(huán)內酯類藥物因具有調節(jié)機體免疫功能和良好的抗生物被膜特性而被廣泛用于臨床重癥感染的治療。已有研究表明，阿奇霉素能夠有效地抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并且對已形成生物被膜的金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性和抗毒素作用［4］。群體信號感應系統(tǒng)（Q S）調控細菌生物被膜形成，而且還參與細菌毒力因子釋放的調控［11］。阿奇霉素在一定程度上抑制Q S調控相關基因的表達，導致藻酸鹽的合成減少，抑制細菌的早期粘附，抑制生物被膜的形成、成熟、甚至破壞已形成的生物被膜。因此，萬古霉素和阿奇霉素聯(lián)合使用治療M RS A引起的生物被膜細菌感染，具有重要的理論意義。

本研究通過體外萬古霉素與阿奇霉素聯(lián)合藥物敏感試驗，根據兩藥物之間的相關作用來判斷對生物被膜形成的M RS A是否具有較好的抗菌活性。試驗所涉及的17株生物被膜形成的M RS A樣本，是經過頭孢西丁紙片法和乳膠凝集法同時鑒定確證。運用棋盤格稀釋法檢測萬古霉素和阿奇霉素聯(lián)合藥敏時的MIC。棋盤格法聯(lián)合藥敏操作簡單易行，重復性較好，但工作量大，不適用于臨床實際工作中大批量的標本檢測。試驗數(shù)據顯示，兩藥聯(lián)合時相加作用占88.2%，協(xié)同作用占11.8%，確定無無關作用和拮抗作用。萬古霉素聯(lián)用后MIC由單用時的1.21m g/L降至0.38m g/L，阿奇霉素聯(lián)用后MIC由單用時的60.24m g/L降至18.94m g/L，差異有統(tǒng)計學意義，提示萬古霉素與阿奇霉素聯(lián)合使用時，對形成生物被膜的M RS A有較好的體外抗菌效果，臨床上可以考慮適當降低兩藥物的治療濃度。綜合分析，在兩藥聯(lián)用過程中，阿奇霉素抑制M RS A菌的多糖合成，降低細菌間的黏附，破壞已形成的生物被膜，提高進入細菌細胞內的通透性，萬古霉素進入菌體后破壞細胞壁，抑制細菌蛋白質的合成，從而達到聯(lián)合殺菌作用。

在實際工作中，還需要進行更多的具有科學性和安全性的試驗，研究體外藥物的抗菌活性與臨床聯(lián)合用藥的相關性，擴大抗菌譜，減小藥物的使用劑量以減少毒副作用，預防和延緩細菌耐藥性的發(fā)生。

［1］韓善橋，劉瑾紅.細菌耐藥的產生機制與控制措施［J］.實用預防醫(yī)學，2010，17（4）:831-832.

［2］S H A R M A M，V I S A I L，B R A G H E R I F，et al.Tol u idine B l u emediated photodynamic e ff ects on staphylococcal bio f ilms［J］.A ntimicrobial Ag ents and C hemotherapy，2008，52（1）:299-305.

［3］M A T A R A CI E，D O SL E R S.I n v itro acti v ities o f antibiotics and antimicrobial cationic peptides alone and in combination a g ainstmethicillin-resistant staphylococc u s a u re u s bio f ilms［J］.A ntimicrob Ag ents C hemother，2012，6（12）:6366-6371.

［4］邢明勛，賈生美，袁鵬，等.阿奇霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用［J］.中國藥科大學學報，2012，43（6）:553-559.

［5］周庭銀，倪語星，胡繼紅，等.臨床微生物檢驗標準化操作（I S O15189認可指導書）［M］.第3版.上海:科學技術出版社，2015:477-478.

［6］賈明，周曄，邵涓涓，等.心臟外科重癥監(jiān)護病房革蘭陽性球菌醫(yī)院感染狀況及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20（3）: 424-426.

［7］濮燕屏，程惠娟，段強軍，等.魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響［J］.中成藥，2015，37（8）:1813-1817.

［8］孔晉亮，張東偉，陳一強，等.同源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力比較［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2013，23（3）:481-483.

［9］鄒琳，劉長庭.利奈唑胺在高齡老年患者中的臨床應用［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20（3）:399-401.

［10］祝進，陸軍，陳衍，等.甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌萬古霉素最低抑菌濃度分布及不同藥敏試驗方法比較［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34（12）:1103-1104.

［11］喬瑞紅，謝鯤鵬，謝明杰.葡萄球菌生物被膜的基因調控機制研究進展［J］.微生物學報，2015，55（10）:1238-1244.

（申海菊 編輯）

In vitro antim icrobial effect of Vancom ycin combined w ith Azithrom ycin on M ethicillin-resistant Staphylococci aureus w ith biofilm

Li Huang
（Clinical Laboratory，Tongling Municipal Hospital，Tongling，Anhui 244000，China）

ObjectiveToexploretheinvitroantimicrobial effect of Vancomycincombinedwith Azithromycin on Methicillin-resistant Staphylococci aureus（MRSA）with biofilm.M ethods MRSA were detected using Cefoxitin disk diffusion method and MRSA latex agglutination test.Biofilm was detected using Congo red medium.Fractional inhibitory concentration（FIC）of Vancomycin combined with Azithromycin was detected by broth dilution checkerboard joint susceptibility testing，which could show the related effects.Results The minimal inhibitory concentration（MIC）of Vancomycin combined with Azithromycin was significantly lower than that of each drug alone；the combined medication showed additive effect（88.2%）and synergistic effect （11.8%），but no irrelevant or antagonism effect.Additive effect was decided when FIC value was 0.5-1.0. Synergistic effect was decided when FICvalue was≤ 0.5.Conclusions The in vitro inhibitory effect of Azithromycin combined with Vancomycin against MRSA with biofilm is obvious，which can effectively reduce the clinical doses and the side effects of the drugs.

MRSA；biofilm；checkerboard dilution method；Vancomycin；Azithromycin

R 378.11

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.023

1005-8982（2016）15-0119-04

2016-02-24