向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件的研究

胡文婕,　郭丹丹,　梁　宇,　景　嵐

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 呼和浩特　010019)

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向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件的研究

胡文婕,郭丹丹,梁宇,景嵐*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 呼和浩特010019)

以向日葵銹菌330生理小種為材料,研究了夏孢子萌發(fā)的適宜條件和培養(yǎng)載體。向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)適宜溫度范圍10～25℃,最適溫度15℃。15℃下在瓊脂薄膜上1 h即可萌發(fā),12 h達到萌發(fā)高峰,萌發(fā)率最高可達97%。孢子在無菌水中萌發(fā)最適濃度為20 mg/L,萌發(fā)率隨濃度增大而降低。光照在前5 h均抑制夏孢子萌發(fā),但7 h后光照對夏孢子總萌發(fā)率基本無影響。新鮮夏孢子萌發(fā)率較高,在室溫放置270 d后基本喪失萌發(fā)能力。最適條件下,在供試的6種不同萌發(fā)載體上,夏孢子萌發(fā)率、芽管長度及萌發(fā)形態(tài)顯著不同,瓊脂薄膜載玻片、尼龍紗網(wǎng)、玻璃紙較適宜夏孢子萌發(fā),萌發(fā)率超過90%;在PVDF膜和親水濾膜上可觀測到芽管內(nèi)部黃色物質轉移和特殊結構的形成。

向日葵銹菌;夏孢子;萌發(fā)條件;萌發(fā)率

向日葵銹菌(Pucciniahelianthi)引起的向日葵銹病是向日葵生長發(fā)育過程中常見的真菌性病害,1822年美國科學家Schweinitz首次描述了向日葵銹菌[1]。近年來,隨著向日葵種植面積的擴大以及連年種植,致病力更強的小種的出現(xiàn)和發(fā)展[24]致使向日葵銹病流行的潛在威脅和涉及范圍不斷增加,從而嚴重威脅向日葵的生產(chǎn)。銹菌長期以來受到高度重視的主要原因,一方面是其給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟帶來巨大的損失,另一方面是銹菌具有其獨特的生物學特性,具有很高的研究價值[5]。夏孢子作為銹菌的主要無性孢子形態(tài),是銹菌唯一能不斷重復發(fā)生的階段,不需要經(jīng)過休眠就能萌發(fā),落到新寄主上24 h內(nèi)即可萌發(fā)產(chǎn)生芽管變成雙核菌絲,雙核菌絲在幾天內(nèi)就可以形成新的夏孢子堆,對銹病的大規(guī)模暴發(fā)起著決定性作用。目前,銹菌夏孢子萌發(fā)相關研究較多,如小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)[67]、松楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)[8]、苜蓿銹菌(Uromycesstriatus)[9]等,但是關于向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件,僅1970年Hennessy等[10]有過簡單報道。本研究采用超聲波水霧法[6],對向日葵銹菌夏孢子進行萌發(fā)試驗,以探明影響向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的主要因素,并研究了不同載體對向日葵銹菌萌發(fā)率和芽管形態(tài)的影響,旨在通過對向日葵銹菌夏孢子人工萌發(fā)條件的研究,掌握適宜于其他研究目的的試驗基礎條件,為進一步研究夏孢子對寄主侵染和致病機制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試向日葵銹菌(PucciniahelianthiSchw.)330生理小種由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學植病研究室提供。在感病品種‘黑大片’上進行隔離繁殖,收集新鮮銹菌夏孢子進行萌發(fā)試驗。

1.2試驗方法

將1%的瓊脂培養(yǎng)基融化后用移液槍取500 μL于親水載玻片上制成瓊脂薄膜,用雙層紗網(wǎng)將少量夏孢子均勻抖落于瓊脂薄膜上,將載玻片置于保鮮盒中的玻璃彎管上,同時在保鮮盒底部加少量無菌水,用超聲波加濕器使保鮮盒內(nèi)處于水霧飽和,然后加蓋密閉培養(yǎng)。(以下試驗如無特別說明,均采用此方法。)

1.2.1溫度對夏孢子萌發(fā)的影響

在黑暗條件下培養(yǎng)溫度分別設置為-20、0、5、10、15、20、25、30、35、40℃,分別在2、4、8、12 h時統(tǒng)計各處理下新鮮夏孢子的萌發(fā)率。

1.2.2光照對夏孢子萌發(fā)的影響

將光照環(huán)境設置為全黑暗和全光照(2 400 lx)2種,置于15℃恒溫培養(yǎng)8 h,每小時觀察一次,統(tǒng)計各時間段夏孢子萌發(fā)率。

1.2.3存放時間對夏孢子萌發(fā)的影響

收集病葉上新鮮夏孢子,分別在20℃環(huán)境下干燥處理后密封離心管中并分別存放1、30、90、150、210、270 d,然后對夏孢子進行萌發(fā)處理,置于黑暗條件下15℃恒溫培養(yǎng),分別于4、8、12、24 h觀察并統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.2.4孢子濃度對夏孢子萌發(fā)的影響

將200 mL無菌水倒入30 cm×45 cm的盤中,再將稱量好的新鮮夏孢子均勻抖落于水面,使最終濃度為20、30、40、50 mg/L,置于黑暗條件下15℃恒溫培養(yǎng)。分別于2、4、8、12 h觀察并統(tǒng)計夏孢子萌發(fā)率。

1.2.5不同培養(yǎng)載體對夏孢子萌發(fā)的影響

采用親水載玻片、瓊脂薄膜載玻片、PVDF膜(polyvinylidene fluoride film, 0.45 μm孔徑)、親水濾膜(0.45 μm孔徑)、玻璃紙(cellophane paper)、尼龍紗網(wǎng)(250 μm孔徑)6種不同載體。將玻璃紙和尼龍紗網(wǎng)濕潤后置于親水載玻片上,親水濾膜和PVDF膜安放在鋪有水飽和濾紙的親水載玻片上,用瓊脂培養(yǎng)基在親水載玻片上制成薄膜,并用親水載玻片作為參照進行萌發(fā)試驗,分別于2、4、8 h觀測萌發(fā)率和芽管長度,親水濾膜和PVDF膜采用側光照射,儀器型號為OLYMPLUS SZX16。

1.3統(tǒng)計與分析

以芽管長度大于孢子直徑的1/2以上作為夏孢子萌發(fā)標準[11]。在普通光學顯微鏡下觀察夏孢子的萌發(fā)情況。每個處理3個重復,每個重復取不同視野觀察不少于300個孢子。統(tǒng)計鏡檢總孢子數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù),計算夏孢子萌發(fā)率,運用Microsoft Excel和SPSS軟件對各處理進行差異顯著性分析。

2　結果與分析

2.1培養(yǎng)溫度對夏孢子萌發(fā)的影響

試驗結果(圖1)表明,在供試溫度范圍內(nèi),夏孢子在-20℃和40℃時未見萌發(fā),其余0～35℃環(huán)境下均可萌發(fā),其中適宜萌發(fā)溫度為10～25℃,夏孢子在最適溫度15℃時2 h萌發(fā)率可達到51.5%,至4～8 h達到萌發(fā)高峰,12 h萌發(fā)率達97%。當溫度低于5℃或高于30℃時,夏孢子萌發(fā)率顯著降低,在35℃時只有極少量萌發(fā)。適宜的溫度條件下,培養(yǎng)時間越長,孢子萌發(fā)率越高。

2.2光照對夏孢子萌發(fā)的影響

如圖2所示,夏孢子在黑暗條件下處理1 h萌發(fā)率便可達33%,顯著高于光照條件下處理1 h 的萌發(fā)率(14%)。在夏孢子萌發(fā)初期,黑暗條件明顯促進孢子萌發(fā),在1～5 h萌發(fā)率存在顯著差異,培養(yǎng)至6 h后萌發(fā)率無顯著差異,8 h均可達到95%左右。

2.3存放時間對夏孢子萌發(fā)的影響

研究結果顯示,新鮮夏孢子在培養(yǎng)24 h時萌發(fā)率為97%,顯著高于室溫干燥條件下存放的孢子萌發(fā)率。夏孢子在20℃,干燥條件下存放30、90、150、210、270 d后的24 h的萌發(fā)率分別為77%、24%、18%和7%,存放270 d后的夏孢子萌發(fā)率僅為3%,基本喪失萌發(fā)能力,說明夏孢子萌發(fā)率隨著存放時間的增長而明顯降低。

圖1　溫度對向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Effects of temperature on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

圖2　光照對向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.2　Effects of light on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

圖4　孢子濃度對向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.4　Effects of spore concentration on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

2.4孢子濃度對夏孢子萌發(fā)的影響

由圖4可以看出,在與空氣接觸面積一致條件下,使用水培法使夏孢子萌發(fā),不同孢子濃度對夏孢子萌發(fā)影響很大,當孢子濃度為20 mg/L時萌發(fā)率最高,12 h時可達到93%,隨著孢子濃度的增大,孢子萌發(fā)率呈下降趨勢,當孢子濃度為50 mg/L時,12 h時萌發(fā)率僅為37%。

2.5不同培養(yǎng)載體對夏孢子萌發(fā)的影響

表1數(shù)據(jù)顯示,在不同培養(yǎng)載體上夏孢子萌發(fā)率存在顯著差異。供試的6種培養(yǎng)載體中,瓊脂薄膜最適合孢子的萌發(fā),培養(yǎng)8 h后萌發(fā)率可達93.5%,明顯高于其他載體。其次是尼龍紗網(wǎng)和玻璃紙,分別達到88.75%和86.13%,而孢子在PVDF膜、親水濾膜和親水載玻片上萌發(fā)率基本無差異,均在46%左右。

從芽管長度來看(表2),培養(yǎng)2 h后,瓊脂薄膜上夏孢子萌發(fā)芽管最長,載玻片上的最短;PVDF膜、親水濾膜、玻璃紙及尼龍紗網(wǎng)上的芽管長度沒有顯著差異,8 h時夏孢子芽管在瓊脂薄膜上平均長度為473.85 μm,明顯高于其他載體,然后依次為是尼龍紗網(wǎng)、玻璃紙、親水濾膜。而親水載玻片和PVDF膜上芽管生長與其他載體相比較慢,8 h時平均長度分別為178.90 μm和168.16 μm。

表1　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)率1)

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

表2　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)芽管長度

觀察不同載體上孢子萌發(fā)形態(tài),在瓊脂薄膜載玻片(圖5a)上可以清晰地看到夏孢子芽管伸長和移動,芽管在瓊脂中伸長沒有方向性;尼龍紗網(wǎng)(圖5b)上孢子萌發(fā)芽管較其他載體更為順直;在親水載玻片(圖5c)上可以觀察到夏孢子萌發(fā)時孢子內(nèi)部物質隨芽管伸長在芽管內(nèi)部顆粒狀不均勻分布。夏孢子在玻璃紙(圖5d)上萌發(fā)芽管清晰且萌發(fā)程度較為一致。使用側光照射親水濾膜(圖5e)可以觀察到孢子鮮黃色且有光澤,芽管伸長時有黃色物質從孢子內(nèi)流入芽管,而在PVDF膜(圖5f)上萌發(fā)后可觀察到芽管尾部膨大,黃色物質隨芽管伸長流入尾部膨大處,呈鮮黃色水滴狀,其他載體均未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

圖5　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌萌發(fā)夏孢子形態(tài)Fig.5　Forms of germinated urediniospores of Puccinia helianthi on different culture substrates

3　結論與討論

夏孢子反復侵染是向日葵銹病大規(guī)模發(fā)生的主要原因,研究銹病首先必須明確夏孢子的萌發(fā)因素及受環(huán)境影響的程度。國內(nèi)外對向日葵銹菌夏孢子的研究主要集中于侵染條件和侵染結構方面[1213],對影響夏孢子萌發(fā)因素鮮有報道,因此本試驗在前人研究的基礎上對溫度、光照、存放時間和孢子濃度以及不同培養(yǎng)載體對銹菌夏孢子萌發(fā)的影響進行了研究。

試驗結果表明,向日葵銹菌夏孢子的萌發(fā)與外界環(huán)境條件密切相關,條件適宜的情況下,新鮮孢子1 h便開始萌發(fā),8 h萌發(fā)率可達90%以上,萌發(fā)時芽管頂端略微膨大,一般每個夏孢子產(chǎn)生1個芽管,少數(shù)產(chǎn)生2個芽管,未發(fā)現(xiàn)多個芽管的現(xiàn)象。萌發(fā)時孢子內(nèi)部黃色的物質隨著芽管伸長流入芽管尾部。夏孢子萌發(fā)溫度范圍較廣,0～35℃均可萌發(fā),10～25℃為適宜萌發(fā)溫度,與Kochman等[10]在1983年得出的15～25℃最適侵染溫度及Shtienberg和Vintal[14]在1993年的研究結果10～24℃基本一致。黑暗環(huán)境在孢子萌發(fā)初期可以促進孢子萌發(fā),但達到一定時間,光照對新鮮孢子萌發(fā)率基本無影響,這與小麥條銹菌持續(xù)光照抑制夏孢子萌發(fā),但光照對新鮮夏孢子影響較小的結果相近[1516]。使用新鮮的孢子進行生物測定可以確保較高萌發(fā)率[17],試驗證明銹菌夏孢子存放時間對孢子萌發(fā)影響很大,室溫條件下存放270 d的夏孢子基本喪失萌發(fā)能力。與新鮮夏孢子相比,即使存放30 d的夏孢子萌發(fā)率也存在顯著差異,結果與張永紅對小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)研究結論一致[7]。存放時間影響孢子萌發(fā)率的現(xiàn)象在其他非專性寄生菌如蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)[18]、稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)[19]中也同樣存在,孢子萌發(fā)率會隨存放時間增長而下降。夏孢子濃度低于20 mg/L時萌發(fā)率最高,超過30 mg/L時萌發(fā)率顯著降低。浸沒水中會抑制夏孢子萌發(fā),可能與其萌發(fā)需氧有關;而夏孢子在水面上漂浮時,萌發(fā)率會因孢子濃度過高或孢子聚集而降低[2021]。所以在水培條件下應盡量降低孢子濃度。

鑒于水培法不利于對孢子萌發(fā)進行觀察,試驗設置了不同培養(yǎng)載體進行夏孢子萌發(fā)試驗。結果表明,在其他載體上孢子濃度對萌發(fā)率影響很小,只要均勻分散幾乎不受濃度影響。并且載體對夏孢子萌發(fā)的影響直接取決于它的保水性能,證明水分是夏孢子萌發(fā)的關鍵因素之一[56]。瓊脂薄膜載玻片上夏孢子萌發(fā)情況最佳,培養(yǎng)8 h后萌發(fā)率可達93.5%,芽管平均長度為473.85 μm,便于開展實時觀察,適用于觀察不同條件對孢子萌發(fā)的影響,但由于芽管在瓊脂薄膜上伸長沒有方向性而且易長入到瓊脂薄膜內(nèi),收集萌發(fā)孢子較為困難;親水載玻片上孢子萌發(fā)過程清晰易于觀察,但保濕能力較差,萌發(fā)率低且萌發(fā)程度差異較大;玻璃紙較親水載玻片保濕能力強,8 h時萌發(fā)率為86.13%,萌發(fā)程度較為一致且透光性好,方便實時觀察和收集孢子,作為萌發(fā)載體較其他載體更具有優(yōu)越性;使用尼龍紗網(wǎng)做萌發(fā)載體,雖觀察孢子萌發(fā)芽管形態(tài)具有局限性,但萌發(fā)率高且芽管較長,適用于大量收集萌發(fā)孢子及芽管時使用;PVDF膜和親水濾膜作為載體雖然萌發(fā)率較低,但通過側光照射可全方位觀察到孢子萌發(fā)過程和形態(tài),并且可以清晰地看到芽管內(nèi)的黃色物質的轉移過程,這與馬青、康振生等觀察到的向日葵葉片表面銹菌夏孢子芽管結合現(xiàn)象時芽管表現(xiàn)一致[12, 22]。使用紗網(wǎng)和親水濾膜進行試驗的結果與范龍泉等[6]針對不同載體對小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)影響結果基本一致,但以PVDF膜為載體時觀察到向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)時芽管尾部有明顯黃色水滴狀膨大,而小麥條銹菌夏孢子在PVDF膜上萌發(fā)時未見說明。

鑒于目前針對向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件和方法研究較少,對于研究向日葵銹病的發(fā)生規(guī)律和防治方法缺乏基礎依據(jù),本研究在探明向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的基本條件的同時通過對不同載體上夏孢子萌發(fā)率和萌發(fā)形態(tài)的比較,掌握了適用于不同試驗目的的夏孢子萌發(fā)方法,為向日葵銹菌相關研究奠定了基礎條件,對于今后向日葵銹菌侵染機制及夏孢子萌發(fā)侵染相關的生物學研究具有重要意義。

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(責任編輯：田喆)

Germination conditions of the urediospores ofPucciniahelianthi

Hu Wenjie,Guo Dandan,Liang Yu,Jing Lan

(College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot010019, China)

The urediniospores of the race 330 ofPucciniahelianthiwere used to explore the optimal germination conditions and culture substrates. The urediniospores began to germinate in 1 h at 15℃ and reached the maximum germination rate of 97% in 12 hoursinvitro. The results showed that the suitable range of temperature for urediniospore germination was 10-25℃, and the optimal temperature was around 15℃. The optimal inoculation concentration was 20 mg/L in water. Light had inhibitive effect on germination within 5 hours after inoculation, but no inhibitive effect at 7 h. Fresh spores were used for study to assure a high percentage of germination, and it was ascertained that the urediniospores had lost their germination abilities after stored for nine months at room temperature. By microscopy,we found that there was significant difference in germination rate and length of urediniospore germ tubes on the six culture substrates under the optimal temperature and humidity conditions. The germination rate of urediniospores exceeded 90% on hydrophilic slide, nylon gauze and cellophane paper. Moreover, we could observe movement of yellow particulates in the germinated tubes and formation of special structure on PVDF film and millipore filter.

Pucciniahelianthi;urediniospore;germination condition;germination rate

20150429

20150721

國家自然科學基金(3136042)；國家向日葵現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-16)

E-mail:jinglan71@126.com

S 435.655

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.012