楊軍英，林金艷

(河南師范大學(xué)體育學(xué)院,河南新鄉(xiāng)　453007)

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懷牛膝多糖結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)肝再生大鼠骨髓增殖的影響

楊軍英，林金艷

(河南師范大學(xué)體育學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007)

為了探討牛膝多糖(Achyranthes bidentatapolysaccharides，ABPS)結(jié)合耐力訓(xùn)練對(duì)部分肝切除(Partialhepatectomy，PH)大鼠骨髓增殖的影響，對(duì)經(jīng)過28d游泳訓(xùn)練(Swimmingtraining，ST)、灌胃ABPS的大鼠行2/3 部分肝切除手術(shù)，觀察術(shù)后大鼠的運(yùn)動(dòng)能力和骨髓細(xì)胞的形態(tài)和增殖情況.結(jié)果表明，游泳訓(xùn)練能夠明顯延長(zhǎng)正常大鼠的游泳運(yùn)動(dòng)致力竭時(shí)間(P<0.01)，降低骨髓細(xì)胞PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)的表達(dá).ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練能夠明顯延長(zhǎng)PH大鼠的游泳致力竭時(shí)間(和PH+ST對(duì)比， P<0.01)，使骨髓增生程度更活躍，有核細(xì)胞數(shù)增多，紅細(xì)胞數(shù)量減少，促進(jìn)了骨髓細(xì)胞PCNA的表達(dá)(和PH相比， P<0.01)，使G2/M期和S期細(xì)胞均明顯減少，G0/G1期增多(P<0.05).提示牛膝多糖結(jié)合耐力訓(xùn)練增強(qiáng)了大鼠在肝臟部分切除手術(shù)后的運(yùn)動(dòng)能力，逆轉(zhuǎn)了耐力訓(xùn)練對(duì)骨髓細(xì)胞增殖的抑制作用.

大鼠;牛膝多糖;游泳訓(xùn)練;骨髓細(xì)胞;增殖細(xì)胞核抗原

懷牛膝是常用的大宗中藥材，是享有盛譽(yù)的“四大懷藥”之一，具有“補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨”的功效.懷牛膝因其“引血下行”的特點(diǎn)而長(zhǎng)于補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)腰膝，用于寒濕痿痹、四肢拘攣，膝痛不可屈伸等骨、關(guān)節(jié)疾病的治療.作為牛膝的主要藥效成分，牛膝多糖(Achyranthes bidentatapolysaccharides，ABPS)具有促進(jìn)軟骨修復(fù)[1]、防治骨關(guān)節(jié)炎、保護(hù)肝臟[2]、延緩衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功效[3]，具有廣闊的藥物開發(fā)及應(yīng)用前景.研究表明ABPS能夠增強(qiáng)動(dòng)物的抗氧化酶活性和免疫功能[4]，對(duì)大鼠的肝臟再生具有促進(jìn)作用[5-6].為了研究ABPS對(duì)骨髓增殖的影響，本研究采用大鼠 2/3 肝切除模型，探討懷牛膝多糖結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)大鼠骨髓增殖的作用，為牛膝的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料.

1　材料和方法

1.1儀器與試劑

流動(dòng)水動(dòng)物游泳池、KD-202型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)、Eclipse80i顯微鏡(Nikon公司)、光學(xué)顯微鏡(Nikon公司)、流式細(xì)胞儀(BD公司)、低溫高速離心機(jī)等.

懷牛膝采自河南溫縣，由河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心李金亭博士鑒定并提供.藥材粉粹、煎煮、過濾后，按照文獻(xiàn)[7]方法制備懷牛膝多糖(ABPS)，純度為51%.以PBS配制成10mg·mL-1，高壓滅菌后備用.

PCNA一抗(Santa公司)，羊抗小鼠IgG-Biotin二抗(武漢博士德生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素(Horseradishperoxidasestreptavidiv，Vector公司)，BSA封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB酶底物顯色劑(北京索萊寶科技有限公司)、碘化丙啶(Propidiumiodide，Sigma公司)、RNA酶(上海生工生物工程有限公司)等.

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只，體重180～220g，由河南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.自由飲水、攝食，常規(guī)飼養(yǎng).

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組和給藥Wistar大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)篩檢，篩選出60只參與實(shí)驗(yàn).大鼠按稱重隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組(Sedentarycontrol，SC)、游泳訓(xùn)練組(Swimmingexercisetraining，ST)、部分肝切除組(Partialhepatectomy，PH)、部分肝切除+游泳訓(xùn)練組(Partialhepatectomy+swimmingtraining，PH+ST)、游泳訓(xùn)練+牛膝多糖低劑量組(Swimmingtraining+ABPS2g·Kg-1·d-1，ST+ABPS2)、游泳訓(xùn)練+牛膝多糖高劑量組(Swimmingtraining+ABPS4g·Kg-1·d-1，ST+ABPS4)，每組10只.ST+ABPS2和ST+ABPS4組大鼠每次上午訓(xùn)練開始前1h灌胃給予相應(yīng)劑量ABPS，其余大鼠給予等量PBS.手術(shù)當(dāng)日和術(shù)后給藥不間斷.

1.3.2訓(xùn)練方案除SC和PH兩組大鼠外，其余大鼠均進(jìn)行游泳訓(xùn)練.游泳池水深60cm，水溫(32±2)℃，水流量為4m3·h-1.訓(xùn)練周期為每周5d，每天2次.訓(xùn)練28d后對(duì)大鼠進(jìn)行部分肝切除手術(shù)，術(shù)后96h開始連續(xù)訓(xùn)練3d.訓(xùn)練強(qiáng)度見表1.

1.3.3大鼠2/3肝切除模型制備參照Higgins等文獻(xiàn)[9]方法，對(duì)大鼠(除SC和ST組之外的所有大鼠)進(jìn)行2/3 肝切除手術(shù).無菌切除肝左葉和中葉后，縫合切口，于上述飼養(yǎng)條件下分籠飼養(yǎng).

1.3.4運(yùn)動(dòng)能力第6周第1d給藥后 1h，檢測(cè)大鼠負(fù)重(5% 體重)力竭游泳時(shí)間來評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力.以大鼠沉入水面下 3 次，每次 20s不能自行浮出水面，四肢運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)作為力竭標(biāo)準(zhǔn)，記錄大鼠力竭時(shí)間.

1.3.5大鼠骨髓細(xì)胞增生度和形態(tài)學(xué)觀察脫頸處死大鼠，解剖、分離其右后側(cè)股骨，剖開骨髓腔，暴露出紅色的骨髓組織，制備印片.每個(gè)樣品重復(fù) 3 次，室溫自然晾干.用吉姆薩-瑞氏混合染液靜置染色 20min，中性樹膠封片.在低倍鏡下觀察有核細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例，判斷骨髓細(xì)胞的增生度，在高倍鏡下進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察.

表1　大鼠游泳訓(xùn)練方案

1.3.6大鼠骨髓細(xì)胞PCNA的表達(dá)分離大鼠左后側(cè)股骨，打開兩側(cè)干骺端，用RPMI-l640 培養(yǎng)基沖出骨髓細(xì)胞，過 400 目細(xì)胞篩后獲得單細(xì)胞懸液.單細(xì)胞懸液用4%多聚甲醛固定后涂片，用細(xì)胞免疫化學(xué)方法進(jìn)行染色.DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，進(jìn)行脫水、透明后中性樹膠封片，鏡檢.統(tǒng)計(jì)每張切片 3 個(gè)視野的陽性細(xì)胞率，計(jì)算PCNA表達(dá)的百分比.

1.3.7大鼠骨髓細(xì)胞的細(xì)胞周期取骨髓單細(xì)胞懸液，用密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞.臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性.取細(xì)胞活性≥95%的單個(gè)核細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105～1×106個(gè)·mL-1，用冰凍無水乙醇固定細(xì)胞，-20 ℃ 凍存?zhèn)溆?

取固定的骨髓單個(gè)核細(xì)胞樣品，用PBS洗滌除去無水乙醇，用碘化丙錠復(fù)合染液避光染色30min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期.

1.3.8數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPASS做統(tǒng)計(jì)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著.

2　結(jié)果

2.1ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練增強(qiáng)PH大鼠的運(yùn)動(dòng)能力

負(fù)重游泳能夠直觀的檢測(cè)藥物制劑抗疲勞的效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，游泳訓(xùn)練能夠明顯延長(zhǎng)正常大鼠的力竭時(shí)間(和SC對(duì)比，P<0.01)，PH降低了SC大鼠和ST大鼠的運(yùn)動(dòng)能力(分別和SC，ST對(duì)比，P<0.05，P<0.01).ABPS結(jié)合游泳運(yùn)動(dòng)能夠明顯延長(zhǎng)PH大鼠的游泳運(yùn)動(dòng)致力竭時(shí)間(和PH+ST對(duì)比，P<0.01)，增強(qiáng)其運(yùn)動(dòng)能力.結(jié)果提示，ABPS結(jié)合游泳運(yùn)動(dòng)能夠縮短手術(shù)損傷后運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)時(shí)間.

圖1　ABPS 結(jié)合耐力訓(xùn)練對(duì) PH大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

與SC相比，**P<0.01；與ST比較，##P<0.01； 與ST+PH比較， △P<0.05，△△P<0.01

ComparedtoPH,**P<0.01；comparedtoST,##P<0.01；comparedtoST+PH, △P<0.05,△△P<0.01

2.2ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練刺激PH大鼠的骨髓增生

本研究直接用骨髓印片，更好地保持了骨髓細(xì)胞的形態(tài)，真實(shí)地反映了骨髓細(xì)胞在體內(nèi)的實(shí)際增生情況.SC和ST大鼠的骨髓腔充盈，呈紅色.PH大鼠骨髓腔組織略疏松，顏色淺.骨髓細(xì)胞染色常采用吉姆薩-瑞氏混合染色法，綜合吉姆薩染色和瑞氏染色法的優(yōu)勢(shì)，將血紅蛋白、嗜酸性顆粒等嗜酸性物質(zhì)染成淡粉紅色，細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞等嗜堿性物質(zhì)染成藍(lán)紫色，中性顆粒染成淺紫色.吉-瑞染色法使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和胞內(nèi)顆粒著色鮮艷，對(duì)比鮮明.

從圖2可以看出骨髓細(xì)胞的分類和有核細(xì)胞的增生程度，SC和ST組骨髓增生活躍，PH組大鼠骨髓增生明顯活躍，有核細(xì)胞數(shù)目變化不明顯，成熟紅細(xì)胞較少.與PH組相比，PH+ST組沒有明顯變化，而ST+ABPS組大鼠的骨髓增生程度更活躍，有核細(xì)胞數(shù)增多，紅細(xì)胞數(shù)量略少.

圖2　ABPS 結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì) PH大鼠骨髓細(xì)胞形態(tài)的影響

A-F分別指SC、ST、PH、ST+PH、ST+ABPS2 和ST+ABPS4 組

A-FrepresentthegroupsofSC,ST,PH,ST+PH,ST+ABPS2andST+ABPS4respectively

2.3ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練刺激PH大鼠的骨髓細(xì)胞增殖

PCNA是DNA合成不可或缺的因子，其表達(dá)與細(xì)胞增殖周期有關(guān)，是判斷細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物之一.如圖 3示，和SC相比，游泳訓(xùn)練導(dǎo)致PCNA表達(dá)降低(P<0.01)，ST+ABPS4 促進(jìn)了其表達(dá)(P<0.05).游泳訓(xùn)練補(bǔ)充ABPS增強(qiáng)了PH大鼠骨髓細(xì)胞PCNA的表達(dá)(和PH相比，P<0.01).ST+ABPS4PCNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01).提示游泳訓(xùn)練降低了大鼠骨髓細(xì)胞增殖，PH后骨髓增殖激活，ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練可以逆轉(zhuǎn)游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的骨髓抑制.

圖3　ABPS 結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)PH大鼠骨髓細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

與SC比較，*P<0.05， ** P<0.01； 與ST比較，##P<0.01； 與ST+PH比較， △P<0.01.

ComparedtoSC, *P<0.05， **P<0.01；comparedtoST, #P<0.01；comparedtoST+PH, △P<0.01

2.4ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)PH大鼠骨髓細(xì)胞增殖周期的影響

大鼠2/3肝切除刺激骨髓細(xì)胞增殖(圖4).和SC相比，PH組大鼠骨髓細(xì)胞聚集在G2/M期，G0/G1期細(xì)胞減少(P<0.05).ST+PH和ST+ABPS組G2/M期細(xì)胞均明顯多于SC組(P<0.05).相比ST組，PH組G0/G1期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞明顯增多(P<0.05).ST+ABPS則誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞聚集在G0/G1期(P<0.05)，G2/M期和S期細(xì)胞均明顯減少(P<0.05).

3　討論

肝臟在不同損傷情況下，存在肝細(xì)胞再生和肝祖細(xì)胞再生兩種不同的再生形式[10].隨著對(duì)干細(xì)胞認(rèn)識(shí)的深入，證明了骨髓造血干細(xì)胞可以橫向分化為肝臟細(xì)胞，表明骨髓來源的干細(xì)胞參與了肝臟再生[11]，骨髓與肝再生的關(guān)系也受到了關(guān)注.當(dāng)肝臟受損時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在干細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞因子-α刺激下，隨血液循環(huán)聚集到肝臟的損傷部位.肝臟損傷啟動(dòng)了特定的肝再生微環(huán)境，刺激BMSCs增殖、分化、轉(zhuǎn)分化成為肝細(xì)胞，并完成整個(gè)肝再生[12].本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練能夠促進(jìn)PH大鼠肝臟再生.同時(shí)，ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練能夠明顯增強(qiáng)PH大鼠的運(yùn)動(dòng)能力.

圖4　ABPS 結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)PH大鼠骨髓細(xì)胞周期的影響

與SC相比，*P<0.05；與ST比較， #P<0.05； 與PH比較， △P<0.05

ComparedtoSC, *P<0.05；comparedtoST, #P<0.05；comparedtoPH, △P<0.05

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，ABPS通過免疫刺激作用，具有抗腫瘤、抗衰老等作用.ABPS能增強(qiáng)正常和環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠外周血中NK細(xì)胞和TNF活性[4]，通過啟動(dòng)和活化巨噬細(xì)胞，糾正老年鼠的免疫低下狀態(tài)[13].牛膝多糖等[5-6]通過促進(jìn)肝細(xì)胞再生和修復(fù)等保護(hù)肝細(xì)胞，調(diào)節(jié)動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)抗氧化酶活性等，對(duì)部分肝切除導(dǎo)致的肝損傷具有保護(hù)作用.牛膝多糖+游泳訓(xùn)練對(duì)游泳訓(xùn)練大鼠Th1和Th2型細(xì)胞平衡有一定的調(diào)節(jié)作用，能夠預(yù)防免疫能力的下降[7].本研究通過4周游泳訓(xùn)練結(jié)合牛膝多糖處理，探討大鼠骨髓細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)ABPS結(jié)合游泳訓(xùn)練使大鼠的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，這和周麗麗等的報(bào)道一致[8]，使大鼠骨髓增生程度更活躍，有核細(xì)胞數(shù)增多，紅細(xì)胞數(shù)量略少，促進(jìn)了骨髓細(xì)胞PCNA的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞聚集在G0/G1 期，G2/M期和S期細(xì)胞均明顯減少，逆轉(zhuǎn)了游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的骨髓抑制.

綜上所述，懷牛膝多糖結(jié)合游泳訓(xùn)練能夠提高PH術(shù)后大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，逆轉(zhuǎn)耐力游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的骨髓抑制.此研究結(jié)果對(duì)牛膝多糖在肝損傷后運(yùn)動(dòng)能力和骨髓增殖方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ).

[1]方芳，鄒來勇，湯群珍.牛膝多糖對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)的影響[J].河北中醫(yī)，2014,36(5):749.

[2]LIH,LIUX,LIY,etal.EffectsofthepolysaccharidefromPholiotanamekoonhumancytokinenetworkinserum[J].Int J Biol Macromol,2012；50(1):164.

[3]林平冬，翁霞萍，劉發(fā)元，等.牛膝有效成分防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制探討[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2015；4(2):56.

[4]邵樹軍，劉彩玉，劉雄伯，等.牛膝多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的研究[J].腫瘤防治雜志，2002,9(1):57.

[5]陳坤.牛膝對(duì)肝臟損傷保護(hù)作用的研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2010.

[6]SONGYH,LIUQ,LVZP,etal.ProtectionofapolysaccharidefromSalviamiltiorrhiza,aChinesemedicinalherb,againstimmunologicalliverinjuryinmice[J].Int J Biol Macromol,2008；43(2):170.

[7]魏濤，何培新，封盛雪，等.懷牛膝多糖的超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011；37(2):191.

[8]周麗麗,王啟榮,伊木清,等.中藥多糖對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及活化T細(xì)胞數(shù)量的影響[J].西安體育學(xué)院學(xué)報(bào),2006；23(4):63.

[9]HIGGINSGM,ANDERSONRM.Experimentalpathologyoftheliver:restorationoftheliverofthewhiteratfollowingpartialsurgicalremoval[J].Arch Patho，1931；12(2):186.

[10]RIEHLEKJ,DANYY,CAMPBELLJS,etal.Newconceptsinliverregeneration[J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26 (1):203.

[11]TOBIASC,MICHAELP,MANNS,etal.Stemcellsinliverregenerationandtherapy[J].Molecular Biomedicine,2008,331(1):27.

[12]魏尉,袁丁.骨髓造血干細(xì)胞與肝臟再生相關(guān)性研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志,2008,5(3):118.

[13]李宗鍇，李電東.牛膝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用.藥學(xué)學(xué)報(bào),1997，32(12):881.

(責(zé)任編輯俞詩源)

EffectofABPScombinedwithswimmingtrainingontheproliferationofbonemarrowcellsinratsafterpartialhepatectomy

YANG Jun-ying,LIN Jin-yan

(School of Physical Education,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China)

InordertoinvestigatetheeffectofABPScombinedwithswimmingtrainingontheproliferationofbonemarrowcellsinratsafterpartialhepatectomy,theadultwistarratsareperformedwith2/3partialhepatectomyafter4weeksswimmingtrainingcombinedwith2and4g·kg-1·d-1ABPS，thentheathleticabilityandthemorphologyandproliferationofthebonemarrowcellsareobserved.Theresultsshowthattheswimmingtrainingcouldprolongtheswimmingtimetoexhaustremarkably(P<0.01),decreasedtheexpressionofPCNA.ABPScombinedSTcouldalsoprolongexhaustivetime(comparedtoPH+STgroup,P<0.01),theresultofWright-Giemsastainshowmoreaccuratelyofbonecellshyperplasia,morekaryocytesandlowerRBC,enhancedthePCNAexpression(comparedwithPHgroup，P<0.01),andinducebonemarrowcellgatheredinG0/G1,decreasethecellsinG2/MandSphase(P<0.05).AndnoremarkabledifferenceofmorphologyandhistologyisfoundbetweentheABPS+STandSC(sedentarycontrol)group.ItimplysthatABPScombinedwithSTcanimprovetheathleticabilityofPHrat,withstoodtheinhibitionofproliferationofbonemarrowcellsinducedbyST.

achyranthesbidentatapolysaccharides;swimmingtraining;bonemarrowcells;proliferatingcellnuclearantigen

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.04.017

2016-03-10;修改稿收到日期:2016-04-25

新鄉(xiāng)市科技發(fā)展規(guī)劃資助項(xiàng)目(15SF04)

楊軍英(1971—)，女，陜西寶雞人，副教授,博士.主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)損傷與康復(fù).

E-mail:041146@htu.cn

S131.2

A

1001-988Ⅹ(2016)04-0078-05