王　婷，高明波，許繼承，張鈺昆，畢麗君，潘　慧

(1 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧　大連　116600；2 卡硼瑞(北京)科技有限公司，北京　102200)

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響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)鮮地黃葉中梓醇提取工藝的研究*

王婷1，高明波1，許繼承2，張鈺昆1，畢麗君1，潘慧1

(1 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600；2 卡硼瑞(北京)科技有限公司，北京102200)

為了優(yōu)化從鮮地黃葉中提取梓醇，在分析單因素影響的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)對地黃葉中梓醇的提取工藝進(jìn)行研究，并以紫外分光光度計(jì)測定梓醇含量。結(jié)果表明，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)得出的提取地黃葉中梓醇的最佳工藝條件為乙醇濃度80%，提取溫度73 ℃，料液比為1:8，超聲時(shí)間為45 min。最佳優(yōu)化參數(shù)可行，可提高地黃利用率，有利于開發(fā)鮮地黃葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

地黃；梓醇；紫外分光光度計(jì)；響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

地黃為玄參科草本植物(Rehmannia glutinosa Libosch)，是著名的四大懷藥之一。有關(guān)研究表明：地黃為環(huán)烯醚萜類和苷類化合物組成，其中環(huán)烯醚萜類以梓醇為主要成分[1-2]。梓醇有抗癌和降血糖等療效[3-5]，現(xiàn)國內(nèi)外對梓醇人工合成未研究成功，主要是從地黃塊莖中提取。據(jù)吳鵬等[6]的研究表明，地黃葉在臨床中有藥用效，實(shí)驗(yàn)以地黃葉為原材料，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)梓醇提取工藝。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與試劑

材料為鮮地黃葉片；梓醇標(biāo)準(zhǔn)品,購于中國藥品生物制品檢定所；乙醇(AP)等實(shí)驗(yàn)試劑，購于天津市科密歐化學(xué)試劑公司。

1.2主要儀器

UV-5200 紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；S10H Elmasonic 中藥超聲萃取儀，德國；Kern ABS電子天平，德國；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取梓醇標(biāo)準(zhǔn)品3.5 mg，用95%乙醇定容至25 mL，冷藏備用。

分別取配制好的梓醇標(biāo)準(zhǔn)品1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 定容到25 mL，在210 nm處測量吸光度值。

1.3.2單因素考察

(1)超聲時(shí)間

分別稱取粉碎的地黃葉粉12.5 mg，共5份，分別加入8倍量的95%乙醇100 mL，在85 ℃下分別超聲10 min、30 min、20 min、40 min、60 min，靜置24 h后抽濾，95%乙醇定容。再分別吸取1 mL定容至25 mL，用紫外分光光度計(jì)測定。

(2)乙醇濃度

分別稱取地黃粉12.5 mg，共5份，分別加100 mL 55%、65%、75%、85%、95%乙醇，在在85 ℃下超聲20 min后續(xù)操作同上。

(3)料液比

分別稱取地黃粉12.5 mg，共5份，分別加入5、6、7、8、9倍量的95%乙醇，后續(xù)操作同上。

(4)超聲提取溫度

分別稱取地黃粉12.5 mg，共5份，分別加入100 mL 95%乙醇，超聲20 min，超聲溫度分別為55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，后續(xù)操作同上。

(5)驗(yàn)證單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取地黃粉12.5 mg，加入8倍量的95%乙醇，于85 ℃超聲20 min提取，后靜置24 h，第一次抽濾，保存濾液，濾渣加入95%乙醇，重復(fù)以上操作兩次，合并濾液，減壓濃縮定容至100 mL并測定。

1.3.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化梓醇提取工藝

乙醇濃度(A)料液比(B)超聲時(shí)間(C)和提取溫度(D)設(shè)為自變量，響應(yīng)值(W)為梓醇含量。利用Box-Behnken軟件對梓醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，各因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　因素水平設(shè)計(jì)表Table 1　Factor levels design table

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖2～圖5所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取條件為：超聲20 min，95%乙醇，料液比為1:8，超聲溫度為85 ℃。

圖1　超聲提取時(shí)間對梓醇提取量的影響Fig.1　Effect of ultrasonic time on the extraction of catalpol

圖2　乙醇濃度對梓醇提取量的影響Fig.2　Effect of the ethanol concentration on the extraction of catalpol

圖3　料液比對梓醇提取量的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the extraction of catalpol

圖4　提取溫度對梓醇提取量的影響Fig.4　Effect of extraction temperature on the extraction of catalpol

2.2響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2　The experimental design of Box-Behnken and results

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance table

根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，對各因子作回歸性方差分析，由表3得P=0.0129<0. 05， 說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性較好，從表2中選擇兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素并交互，其它因素不變對梓醇提取含量進(jìn)行分析。根據(jù)回歸方程，分析擬合響應(yīng)3D曲面趨勢，如圖6所示。

最佳提取工藝條件為：料液比1:7.25，超聲時(shí)間44.68 min，乙醇濃度81.15%，提取溫度73.30 ℃。將結(jié)果優(yōu)化：料液比1:8，超聲時(shí)間45 min，乙醇濃度80%，提取溫度73 ℃。經(jīng)3次平行試驗(yàn)結(jié)果為梓醇的平均提取量為0.83 mg·g-1。

圖5　各因素交互作用對梓醇得率R1影響的相應(yīng)曲面(3D)及等高曲線Fig.5　The factors interaction on the yield of catalpol R1surface and the corresponding contour

3　結(jié)　論

通過驗(yàn)證單因素實(shí)驗(yàn)，從鮮地黃葉中提取梓醇含量為0.75 mg·g-1。而響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳提取工藝測定的含量為0.83 mg·g-1。結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)鮮地黃葉中梓醇提取工藝具有可行性和實(shí)效性。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)比較，地黃葉中的梓醇比生地黃和熟地黃含量少，但從制藥的廢棄物葉子中提取，提高了地黃的利用率，有利于開發(fā)地黃葉的經(jīng)濟(jì)效益，具有環(huán)境和經(jīng)濟(jì)兩方面的實(shí)際意義。

[1]劉慶豐.滋陰藥地黃中梓醇的制備、鑒定及其藥理作用的初步探討[D].上海:上海第二醫(yī)科大學(xué),2005.

[2]熊輝,朱軍,陳琴華.地黃不同提取工藝中梓醇含量的比較[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2015,17(9):17.

[3]蒙雄裕,徐良，李華強(qiáng)，等. 用RP-HPLC法測定天目地黃中梓醇和毛蕊花?；ㄌ擒盏暮縖J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2015,15(4): 273-276.

[4]魏桂芳,劉雪萍,何希瑞.地黃藥理與臨床應(yīng)用[J].陜西中醫(yī),2013,34(8):1073-1074.

[5]董炤，陳長勛. 梓醇藥理作用的研究進(jìn)展[J].中成藥，2013，35(105)：1047-1051.

[6]陳小婕，曾畫艷，張曉嬌，等. 紫薯花色苷提取的響應(yīng)曲面優(yōu)化及抗氧化作用[J]. 食品科技,2013(09):179-184.

Optimization of Extracting Catalpol from the Leaves of Radix Rehmanniae by Response Surface Design*

WANGTing1,GAOMing-bo1,XUJi-cheng2,ZHANGYu-kun1,BILi-jun1,PANHui1

(1 College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116600;2 Carborine Technologies Ltd., Beijing 102200, China)

To optimize the catalpol extraction procedure from the leaves of Radix Rehmanniae, the content of catalpol was determined by ultraviolet spectrophotometer. Response surface design was applied to find the optimum parameters based on one-factor experiment. Results showed that the best extraction conditions of catalpol from the leaves of Radix Rehmanniae were as follows: 80% ethanol at 73 ℃ for 45 min with an solid-liquid ratio of 1:8 by response surface design. Conclusion was that the optimized extraction procedure was reliable to improve the utilization rate of Radix Rehmanniae and develop new economic benefits from the leaves of Radix Rehmanniae.

Radix Rehmanniae; catalpol; ultraviolet spectrophotometer; response surface design

大連民族大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.S201512026017)。

王婷(1993-)，女，生物工程專業(yè)，主要從事藥物開發(fā)和應(yīng)用。

高明波(1974-)，女，博士，副教授，主要從事藥用植物研究。

R284.2

A

1001-9677(2016)015-0064-03