王　寬　呼雪慶　黃玉薩　王清然　高春鵬　劉　民　劉慧榮

.論著.

不同施灸方向?qū)鲎C大鼠血管收縮與舒張因子的影響

王寬呼雪慶黃玉薩王清然高春鵬劉民劉慧榮

目的 觀察不同施灸方向?qū)鲎C模型大鼠血管收縮與舒張因子的影響.方法選取清潔級(jí)Wistar大鼠32只,隨機(jī)分組:正常組(A)、模型組(B)、順經(jīng)灸組(C)和逆經(jīng)灸組(D),每組8只.在成功建立大鼠寒凝血瘀證模型后,對(duì)順經(jīng)灸和逆經(jīng)灸兩組大鼠實(shí)施不同操作方向的艾灸治療,即沿膀胱經(jīng)分別行"由上至下"及"由下至上"的單向反復(fù)操作,共治療14天.治療結(jié)束后,各組大鼠腹主動(dòng)脈取血,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血漿內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的濃度.按照大鼠癥狀和體征量化評(píng)分表對(duì)大鼠的活動(dòng)、毛發(fā)、大便、小便及脈絡(luò)瘀血等情況進(jìn)行相應(yīng)評(píng)分,并最終計(jì)算大鼠寒凝血瘀的程度.結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿ET-1濃度均明顯升高(P<0.05),NO濃度明顯下降(P<0.05);與模型組比較,順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿ET-1濃度均明顯下降(P<0.05),NO濃度均明顯升高(P<0.05);順經(jīng)灸組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿NO濃度較逆經(jīng)灸組均有明顯差異(P<0.05).結(jié)論 順經(jīng)灸與逆經(jīng)灸大鼠足太陽(yáng)膀胱經(jīng)均能明顯促進(jìn)寒凝血瘀證大鼠血漿NO的釋放,抑制血漿ET-1的釋放,改善大鼠寒凝血瘀癥狀,且順經(jīng)灸的治療效應(yīng)稍優(yōu)于逆經(jīng)灸.

艾灸; 方向; 寒凝血瘀證; 血漿內(nèi)皮素-1; 一氧化氮

艾灸療法是中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)療法中的一項(xiàng)重要組成部分,是經(jīng)過(guò)悠久歷史沉淀的頗具中醫(yī)特色的外治法之一.正是由于艾灸具有預(yù)防保健、強(qiáng)健體魄、延緩衰老以及延年益壽的功效,使得艾灸被廣大的民眾所熟識(shí),甚至遠(yuǎn)揚(yáng)國(guó)外,相關(guān)灸法的研究也受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視.寒凝血瘀證是中醫(yī)臨床常見(jiàn)證型,艾灸活血化瘀的顯著作用,可作為治療寒凝血瘀證的一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)療法.本實(shí)驗(yàn)基于古代醫(yī)籍中有關(guān)艾灸方向的論述,選取寒凝血瘀證動(dòng)物模型,觀察不同施灸方向?qū)鲎C大鼠血管收縮和舒張因子的影響,以期進(jìn)一步規(guī)范臨床艾灸操作流程,完善艾灸的相關(guān)效應(yīng)機(jī)制,提高艾灸療效.

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠32只,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002],適應(yīng)性喂養(yǎng)7天.

1.2試劑及儀器

0.1%鹽酸腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):W131106).醫(yī)用紅外耳式體溫計(jì):江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;ELISA試劑盒:武漢基因美生物科技有限公司;酶標(biāo)儀:芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司;洗板機(jī):芬蘭(Thermo Labsystems)公司;離心機(jī):微量高速離心機(jī)(國(guó)產(chǎn));移液器:吉爾森P型移液器(Pipetman);培養(yǎng)箱:隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn));其他所需耗材均為國(guó)產(chǎn).

1.3動(dòng)物分組及模型制備

將32只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組,每組8只.模型組、順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組寒凝血瘀證大鼠模型參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]制備.具體方法為:采用背部皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素的方式,按0.3 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算注射量,用生理鹽水稀釋5倍后分2次注射.第1次注射后1小時(shí),將大鼠置于4～6℃冰水中冰浴4分鐘,1小時(shí)后進(jìn)行第2次注射,共持續(xù)4周,前2周造模每天進(jìn)行,后2周造模隔天進(jìn)行,且后2周只冰浴不注射鹽酸腎上腺素.正常組大鼠除稱重均不作其他任何處理.

1.4艾灸治療

本實(shí)驗(yàn)選取大鼠背部脊柱兩旁膀胱經(jīng)連線的經(jīng)段("大椎"至"十七椎下"),大鼠膀胱經(jīng)連線距背正中線0.9～1.2 cm.具體定位:大椎:第七頸椎與第一胸椎間,背部正中;十七椎下:第6腰椎橫突的前內(nèi)側(cè).在大鼠寒凝血瘀證模型制備成功后,即開(kāi)始進(jìn)行艾灸治療.順經(jīng)灸組治療時(shí)艾條移動(dòng)的方向與逆經(jīng)灸組彼此相反,且均為單向操作.治療所用艾條均為自制艾條(長(zhǎng)約15 cm、直徑約1 cm),施灸時(shí),艾條距施術(shù)部位皮膚1～2 cm,移動(dòng)均勻緩慢(單向移動(dòng)一次約3～5秒),順經(jīng)灸和逆經(jīng)灸兩組大鼠的艾灸操作分別按照"順膀胱經(jīng)循行的方向"和"逆膀胱經(jīng)循行的方向"進(jìn)行,每天10分鐘,共治療14天.治療期間,正常組大鼠不作處理,模型組大鼠與兩個(gè)治療組行同樣抓取動(dòng)作.

1.5大鼠癥狀和體征觀察

參照相關(guān)文獻(xiàn)及中醫(yī)證候研究[3,5-7],制定寒凝血瘀證大鼠癥狀和體征量化評(píng)分表,詳見(jiàn)表1.通過(guò)觀察大鼠活動(dòng)、毛發(fā)、大便、小便及脈絡(luò)瘀血等一般情況,按照大鼠癥狀和體征量化評(píng)分表對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)評(píng)分,并最終計(jì)算大鼠寒凝血瘀的程度.評(píng)分每周1次,共計(jì)6次.

1.6大鼠耳溫檢測(cè)

用紅外耳式體溫計(jì)分別于造模第1天、8天、16天、24天和28天對(duì)大鼠耳溫進(jìn)行檢測(cè).

1.7大鼠血漿內(nèi)皮素-1及一氧化氮濃度檢測(cè)

治療結(jié)束后,大鼠麻醉,行腹主動(dòng)脈取血,抗凝處理,采用ELISA法檢測(cè)大鼠血漿內(nèi)皮素-1 (endothelin-1,ET-1)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的濃度.

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,大鼠癥狀和體征量化積分(第28天)以及大鼠血漿ET-1、NO濃度均同時(shí)滿足正態(tài)性和方差齊性條件,故采用方差分析;而大鼠癥狀和體征量化積分(治療第7、14天)及大鼠耳溫不同時(shí)滿足正態(tài)性和方差齊性條件,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本間的多重比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1大鼠癥狀、體征量化積分

模型制備過(guò)程中,大鼠逐漸表現(xiàn)出畏寒蜷縮、寒戰(zhàn)、毛發(fā)枯干無(wú)光澤、大便量多質(zhì)稀甚則不成形、小便清長(zhǎng)、口舌暗淡、肛周紫黯等中醫(yī)寒凝血瘀的表征.如表2所示,在造模結(jié)束時(shí)(第28天),與正常組比較,模型組、順經(jīng)灸組及逆經(jīng)灸組大鼠癥狀和體征量化積分均明顯升高(P<0.05),且達(dá)到寒凝血瘀的重度水平,而三組大鼠癥狀和體征量化積分之間無(wú)明顯差異.后經(jīng)過(guò)2周時(shí)間的艾灸治療,順經(jīng)灸和逆經(jīng)灸兩組大鼠以上寒凝血瘀的表現(xiàn)均有明顯好轉(zhuǎn),從表2可以看出,治療結(jié)束后,順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠的癥狀和體征量化積分較模型組均顯著下降(P<0.05),而且順經(jīng)灸組大鼠的癥狀和體征量化積分較逆經(jīng)灸組降低更加明顯(P<0.05).

2.2大鼠耳溫變化

正常組大鼠在模型制備過(guò)程中耳溫變化不明顯,最低時(shí)(36.20±0.17)℃,最高時(shí)(36.40±0.11)℃,而模型組、順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠耳溫變化明顯.隨著模型制備過(guò)程的進(jìn)行,模型組、順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠耳溫均有"先上升后下降"的變化趨勢(shì)(如圖1),在造模結(jié)束時(shí),模型組、順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠耳溫[(35.56±0.13)℃、(35.66±0.34)℃、(35.70±0.25)℃]較正常組明顯降低(P<0.05),且三組大鼠耳溫?zé)o明顯差異(P>0.05),詳見(jiàn)表3.

表1　寒凝血瘀證大鼠癥狀和體征量化評(píng)分表

表2 各組大鼠癥狀和體征量化積分(±s,分)

表2 各組大鼠癥狀和體征量化積分(±s,分)

注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與順經(jīng)灸組比較,cP<0.05.

分組n造模階段第7天第14天第21天第28天治療階段第7天第14天00±0.000.00±0.00模型組83.38±1.066.25±1.588.38±1.5110.63±0.92a10.13±0.99a8.88±1.13a順經(jīng)灸組82.75±0.896.25±0.898.00±1.2011.25±1.28a8.13±0.84a3.63±0.74ab逆經(jīng)灸組82.87±0.356.75±0.898.87±1.1311.38±0.92a8.50±0.93a5.13±0.84正常組80.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000. abc

表3　各組大鼠耳溫變化(±s,℃)

表3　各組大鼠耳溫變化(±s,℃)

注:與正常組比較,aP<0.05.

分組n造模第1天造模第8天造模第16天造模第24天造模第28天0936.36±0.13模型組836.43±0.0936.41±0.3336.56±0.2836.15±0.1535.56±0.13a順經(jīng)灸組836.38±0.2336.18±0.2336.45±0.2235.63±0.3335.66±0.34a逆經(jīng)灸組836.38±0.1336.45±0.2436.33±0.1235.91±0.2435.70±0.25正常組836.40±0.1136.25±0.2636.20±0.1736.35±0. a

圖1　各組大鼠耳溫變化

2.3大鼠血漿ET-1及NO濃度變化

如表4所示,與正常組比較,模型組大鼠血漿ET-1濃度明顯上升(P<0.05),血漿NO濃度明顯下降(P<0.05);與模型組比較,順經(jīng)灸組和逆經(jīng)灸組大鼠血漿ET-1濃度顯著下降(P<0.05),血漿NO濃度顯著上升(P<0.05),其中順經(jīng)灸組大鼠血漿NO濃度水平明顯高于逆經(jīng)灸組(P<0.05).

表4　各組大鼠血漿ET-1及NO濃度(±s,ng/L)

表4　各組大鼠血漿ET-1及NO濃度(±s,ng/L)

注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與順經(jīng)灸組比較,cP<0.05.

8112.26±14.62132.60±9.79模型組8131.20±9.88a102.14±7.23a順經(jīng)灸組8104.13±14.92b136.32±7.49b逆經(jīng)灸組8108.82±19.48b119.46±6.34 ET-1NO正常組組別n bc

3　討論

寒凝血瘀證主要表現(xiàn)為畏寒肢冷、口唇紫黯、舌暗淡(舌下脈絡(luò)瘀曲)、大便量多質(zhì)稀甚或便溏、小便清長(zhǎng)等一系列體征和癥狀,其特點(diǎn)為"寒致瘀".寒邪為陰邪而主收引,寒性凝滯,無(wú)論外寒還是內(nèi)寒,均能導(dǎo)致機(jī)體血液運(yùn)行不暢,而終成血瘀,其病因病機(jī)主要為:寒邪侵襲,血得寒則凝,凝則不通,不通即瘀.《諸病源候論》中指出"寒則血結(jié),溫則血消",《素問(wèn).調(diào)經(jīng)論》中也有:"氣血者,喜溫而惡寒,寒則泣(澀)而不行,溫則消而去之."這些古文獻(xiàn)不但總結(jié)了以上寒凝血瘀證的病因病機(jī),同時(shí)又啟示臨床治療寒凝血瘀證的治療原則,即溫通.

艾灸療法是傳統(tǒng)中醫(yī)中頗具特色的外治法之一,艾灸具有溫經(jīng)通脈、活血化瘀、補(bǔ)虛培本等功效,有"灸治百病"之說(shuō),對(duì)某些病癥的治療效果更是超過(guò)了針和藥[8-9].《千金要方灸例》中提到:"凡灸當(dāng)先陽(yáng)后陰,言從頭向左而漸下,次后從頭向右而漸下,先上后下."《明堂》中也有:"凡病先灸于上,后灸于下,先灸于少,后灸于多,皆宜審之."可見(jiàn)古代醫(yī)家通過(guò)大量的臨床實(shí)踐總結(jié)歸納出了有關(guān)艾灸操作的方向和順序,這在當(dāng)時(shí)應(yīng)該是被認(rèn)為會(huì)影響艾灸療效的關(guān)鍵因素.在當(dāng)代,活血化瘀被公認(rèn)為是艾灸療法最顯著的作用之一,艾灸活血化瘀的作用機(jī)制與改善血液流變學(xué)異常,糾正自由基代謝紊亂,調(diào)節(jié)血管上皮細(xì)胞因子,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境等有關(guān)[10-12].

血管內(nèi)皮是介于血液和血管壁組織之間的單層扁平上皮,是分割血液和組織的屏障,血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌產(chǎn)生一系列血管活性物質(zhì),從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血管收縮和舒張、防止血小板黏附和血栓形成、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及抑制血管壁炎癥反應(yīng)等功能.ET和NO均是血管上皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì),是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子,其中ET被認(rèn)為是迄今為止最強(qiáng)的縮血管物質(zhì),而NO則是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的舒血管物質(zhì).有研究表明[13-17],艾灸可有效調(diào)節(jié)血管ET-1及NO水平,保護(hù)血管上皮功能.本實(shí)驗(yàn)中寒凝血瘀證動(dòng)物模型的病機(jī)特點(diǎn)可概括為"寒則凝,凝則瘀",模型制備過(guò)程中,模擬中醫(yī)"寒則血瘀"的發(fā)病機(jī)制,給予長(zhǎng)時(shí)間的冷刺激,結(jié)合皮下注射鹽酸腎上腺素,大鼠逐漸表現(xiàn)出寒、瘀的表征,在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)28天的造模過(guò)程后,大鼠的整個(gè)機(jī)體都表現(xiàn)出瘀的病理狀態(tài),這與中醫(yī)的整體觀念是基本相符的,同時(shí)也說(shuō)明制備寒凝血瘀證大鼠模型是成功的,而且具有中醫(yī)表征特點(diǎn).研究結(jié)果表明順經(jīng)灸的治療效果優(yōu)于逆經(jīng)灸,這為規(guī)范臨床艾灸操作流程提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),不同施灸方向作為影響艾灸療效的關(guān)鍵因素之一也應(yīng)予以重視,相關(guān)機(jī)制仍需開(kāi)展后續(xù)研究加以解決.

[1] Su S,J Duan,W Cui,et al.Network-based biomarkers for cold coagulation blood stasis syndrome and the therapeutic effects o shaofu zhuyu decoction in rats[J].Evid Based Complemen Alternat Med,2013:901943.

[2] 楊佳敏,沈小雨,張玲,等.寒凝血瘀證動(dòng)物模型制備方法的評(píng)價(jià)與選擇[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2014,29(1):53-54.

[3] 周華妙,郭勇.寒凝血瘀證小鼠動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2010,17(1):1-2,7.

[4] 滕久祥,彭芝配,郭建生,等.九氣拈痛膠囊對(duì)大鼠"寒凝血瘀"模型的影響[J].新中醫(yī),1998,30(11):33-34.

[5] 尹軍祥,田金洲,王永炎,等.血瘀證模型大鼠舌象評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(8):529-531,578.

[6] 杜正彩,郝二偉,鄧家剛.寒凝血瘀證模型大鼠中醫(yī)表征指標(biāo)量化研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,7(7):566-569.

[7] 尹軍祥,田金洲,王永炎,等.寒凝血瘀證表征模型的建立[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(10):682-685,722.

[8] 吳煥淦,嚴(yán)潔,余曙光,等.灸法研究的若干思考[J].上海針灸雜志,2008,27(11):35.

[9] 常小榮,嚴(yán)潔,易受鄉(xiāng),等.關(guān)于灸法標(biāo)準(zhǔn)化研究的思考[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2010,12(2):172-176.

[10] 唐照亮,宋小鴿,王寧新,等.艾灸活血化瘀作用機(jī)制的研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,23(2):24-28.

[11] 金末淑.艾灸膈俞穴對(duì)寒凝血瘀證模型大鼠血液流變學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2009:93.

[12] 譚琳鎣,劉慧榮,吳煥淦,等.艾灸療法活血化瘀作用研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(2):272-274.

[13] 陳思宇,李艷霞,唐素珍.艾灸對(duì)寒凝血瘀證模型大鼠內(nèi)皮素及一氧化氮的影響[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2011,27(5): 292-293.

[14] 楊繼軍,孫立虹,佘延芬,等.隔物灸對(duì)寒濕凝滯型原發(fā)性痛經(jīng)患者內(nèi)皮素和一氧化氮含量的影響[J].針刺研究,2008, 33(6):409-412.

[15] Ye X,Zhang H.Influence of moxibustion temperatures on blood lipids,endothelin-1,and nitric oxide in hyperlipidemia patients [J].J Tradit Chin Med,2013,33(5):592-596.

[16] Pan P,X Zhang,H Qian,et al.Effects of electro-acupuncture on endothelium-derived endothelin-1 and endothelial nitric oxide synthase of rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension [J].Exp Biol Med(Maywood),2010,235(5):642-648.

[17] Yang J J,L H Sun,Y F She,et al.Influence of gingerpartitioned moxibustion on serum NO and plasma endothelin-1 contents in patients with primary dysmenorrhea of cold-damp stagnation type[J].Zhen Ci Yan Jiu,2008,33(6):409-412. (收稿日期:2015-10-13)

(本文編輯:蒲曉田)

Effects of different moxibustion-performed directions on the vascular contraction and relaxation factor on rats with cold gaused blood stasis syndrome

WANG Kuan,HU Xue-qing,HUANG Yu-sa,et al.Shanghai Institute of Acupuncture-Moxibustion and Meridian,Shanghai 200030,China Corresponding author:LIU Hui-rong,E-mail:lhr_tcm@126.com

Objective To observe the effects of different moxibustion-performed directions on the vascular contraction and relaxation factors in rats with cold gaused blood stasis syndrome.Methods 32 Wistar rats were divided into control group(A),model group(B),moxibustion performed along the meridian group(C)and moxibustion performed against the meridian group(D),8 rats in each group.After successful established the model of rats with cold gaused blood stasis syndrome,the moxibusition along or against the bladder meridian on rats were performed directionally and repeatedly,the treatment was for 14 days.After treatment,the levels of ET-1 and NO of the blood taken from rats'aortaventralis were detected by ELISA.According to the table of the quantificational score of symptom,observe the activities,hair,excrement,urinate and choroid blood stasis of rats,and calculate the degree of rats with cold gaused blood stasis syndrome.Results Compared with the A group,the quantificational score of symptom and the levelof ET-1 in the B group were all increased with statistically significant difference(P<0.05)and the NO level was decreased significantly(P<0.05).Compared with the B group,the quantificational score of symptom and the level of ET-1 in the C and D group were reduced significantly(P<0.05),and the NO level increased apparently(P<0.05).The quantificational scores of symptom and NO levels in C and D group has statistical difference(P<0.05).Conclusions Both moxibustion groups can promote the NO release, inhibite the ET-1 release and improve the symptom in rats with cold gaused blood stasis syndrome. Moreover,the therapeutic effect of C group is better than D group.

Moxibustion; Direction; Cold gaused blood stasis syndrome; Endothelin-1; Nitric oxide

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.001

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展(973計(jì)劃)(2015CB554500);上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生"創(chuàng)新能力培養(yǎng)"專項(xiàng)

200030 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所[王寬(碩士研究生)、劉慧榮],藥物安全評(píng)價(jià)中心(呼雪慶、黃玉薩、王清然);上海中醫(yī)藥大學(xué)岳陽(yáng)臨床醫(yī)學(xué)院[劉民(碩士研究生)];上海中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)研究基地蘇州市中醫(yī)院(高春鵬)

王寬(1989-),2013級(jí)在讀碩士研究生.研究方向:針灸治療腸道疾病臨床與基礎(chǔ)研究.E-mail: wangkuan271@163.com

劉慧榮(1976-),女,博士,研究員,博士生導(dǎo)師.研究方向:針灸治療腸道疾病臨床與基礎(chǔ)研究. E-mail:lhr_tcm@126.com