酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留

■ 林品言 杜紅梅（常德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南常德 415000）

酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留

■ 林品言 杜紅梅（常德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南常德 415000）

磺胺類藥物是人工合成的具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，它是應(yīng)用廣泛的抗菌素，對(duì)畜禽疾病控制和治療起到重要作用。但磺胺類藥物存在嚴(yán)重副作用，人體中長(zhǎng)期存在磺胺類藥物會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物產(chǎn)生藥性，且有潛在的致癌性。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件規(guī)定其殘留量為100μg/kg。

目前，用于檢測(cè)磺胺類藥物殘留的分析方法較多，包括液-質(zhì)聯(lián)用法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。酶聯(lián)免疫法作為一種快速篩選方法，具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大批量樣品的初篩，在動(dòng)物性食品的獸藥殘留檢測(cè)中得到廣泛地應(yīng)用。

圖1 磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1 材料與方法

表1 樣品中磺胺類藥物殘留

表2 樣品中磺胺類藥物殘留的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 材料

試驗(yàn)用水產(chǎn)品：市售，將魚(yú)去皮，去骨，沿背部切下肌肉塊，放入勻漿機(jī)中絞碎并混勻，置于-18℃冰箱中冷凍備用。

1.1.2 儀器

MK3酶標(biāo)儀；XW-80A微型旋渦混合儀；CP153C電子天平；GP-125BE干燥培養(yǎng)箱；TG16K-II高速離心機(jī)；XW-80A 微型旋渦混合儀；量筒、試劑槽、離心管、吸水紙巾、移液槍。

1.1.3 試劑

磺胺二十五合一酶聯(lián)免疫（ELISA）快速檢測(cè)試劑盒；正己烷（分析純）；乙酸乙酯（分析純）；中性氧化鋁100目-200目。

1.1.4 試劑盒組成

包被有磺胺類藥物偶聯(lián)抗原的微孔板：96孔（8孔/條×12條）；磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液：6×1mL/瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/ L）；磺胺抗體工作液：1瓶（7mL）；酶標(biāo)二抗溶液：1瓶（7mL）；濃縮洗滌液10×：1瓶（30mL）；濃縮樣品復(fù)溶液10×：1瓶（20mL）；終止液：1瓶（7mL）；底物溶液A：1瓶（7mL）；底物溶液B：1瓶（7mL）；封板膜：1張。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取2±0.05g均質(zhì)樣品于50mL離心管中，加入1±0.05g中性氧化鋁，6mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5min。室溫4,000r/min離心10min。取1.5mL上清液至10mL離心管中，60℃下氮?dú)獯蹈?。殘留物先加?mL 1×樣本復(fù)溶液再加入1mL正己烷，渦旋振蕩10s。室溫4,000r/min離心10min，取下層水相進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.2 樣品測(cè)定

將磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品均做重復(fù)孔。

每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品提取液50μL，然后先后每孔加入酶標(biāo)二抗溶液50μL和抗體工作液50μL。

輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于25℃避光反應(yīng)30min。

小心揭開(kāi)封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

將底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振蕩混勻，每孔加入100μL，25℃避光顯色15min。

每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，5min內(nèi)測(cè)定450nm處吸光度值。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品濃度的計(jì)算

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)樣品、樣品加標(biāo)吸光值（B）除以0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光值（B0）再乘以100%，即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)樣品、樣品加標(biāo)的吸光度比值（%）。以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的百分吸光度比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用回歸方程法，計(jì)算出樣品中磺胺類藥物的濃度。由計(jì)算所得樣品的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中磺胺類藥物的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2步驟，分別測(cè)定濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5和40.5μg/L磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)回歸統(tǒng)計(jì)得到在0.5～40.5μg/L范圍內(nèi)呈線性，磺胺類藥物濃度對(duì)數(shù)值（x，μg/L）與吸光度比值（y=B/B0，%）的線性方程為y=-37.002x+72.475，相關(guān)系數(shù)R為0.9982。從圖1可以看出，磺胺類藥物在0.5～40.5μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 樣品中磺胺類藥物的殘留量

由表1可知，水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留量均小于100μg/ kg，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水產(chǎn)品中磺胺類藥物含量的要求。

2.3 準(zhǔn)確度測(cè)定

準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出：最低回收率為87.5%，最高為104.2%，試劑盒的回收率高。結(jié)果表明，該測(cè)定方法的精度符合微量分析要求

3 討論與結(jié)論

酶聯(lián)免疫法是一種將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析方法。與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)。該試驗(yàn)的檢出限為4μg/kg，平均回收率為87.5%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤4.32%。且在0.5～40.5μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9982。

運(yùn)用該方法進(jìn)行水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，可以用于大批量水產(chǎn)品磺胺類藥物殘留的快速檢測(cè)。在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和日常檢測(cè)中應(yīng)用前景非常廣闊。

酶聯(lián)免疫法雖然操作簡(jiǎn)便，但影響檢測(cè)結(jié)果的因素也較多，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：試劑盒保存于2℃～8℃，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔密封后2℃～8℃存放，并盡快使用，底物溶液要避光保存；使用之前，將樣品及所需試劑的溫度平衡至20℃～25℃，否則可能導(dǎo)致后面檢測(cè)吸光度值偏低；若樣品的百分比吸光值（%）超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)使用1×樣品復(fù)溶液做適當(dāng)稀釋后測(cè)得；不同批號(hào)試劑不能混用；每批次樣品均要進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的影響因素很多，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此，它只是檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的篩選測(cè)定方法，陽(yáng)性樣品再用高效液相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)，獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。（參考文獻(xiàn)略）