■ 孫宇 肖調(diào)義（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

大鯢性腺發(fā)育中激素水平及產(chǎn)卵效果分析

■ 孫宇 肖調(diào)義（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

大鯢屬于由水生脊椎動(dòng)物向陸生脊椎動(dòng)物過(guò)渡的類群，其結(jié)構(gòu)比較原始、獨(dú)特，在研究動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程和地理分布范圍等方面有著重大的科學(xué)價(jià)值，有“活化石”之稱，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。2002年以前，大鯢人工養(yǎng)殖的甚少，繁殖也很少。隨著研究的深入和技術(shù)的成熟，2002年以后繁殖技術(shù)漸漸成熟（章克家，2002；余東勤，2009）。目前人工大鯢養(yǎng)殖規(guī)模最大的是陜西漢中市，劉愛(ài)華在2007年報(bào)道全市大鯢存量約為10萬(wàn)尾，2009年大鯢的養(yǎng)殖總量超過(guò)100萬(wàn)尾，且繁殖產(chǎn)量占全國(guó)比例的70%（刑可利，2001），同年湖南省養(yǎng)殖企業(yè)已有35家左右，大鯢繁殖量在4萬(wàn)～5萬(wàn)（羅慶華，2009）。截至2012年底，貴州大鯢存池量為43.5萬(wàn)尾左右，僅次于陜西；張家界市養(yǎng)殖估規(guī)模也超過(guò)40萬(wàn)尾，至2014年，全國(guó)存量達(dá)到400萬(wàn)尾，人工繁殖和馴養(yǎng)大鯢對(duì)于大鯢資源保護(hù)和有效利用極其有利。

當(dāng)前，在大鯢的人工繁殖過(guò)程中繁殖率較低，人工繁殖工作中關(guān)鍵點(diǎn)即是對(duì)親本成熟情況的準(zhǔn)確掌握； 對(duì)此，陽(yáng)愛(ài)生等 （1981） 對(duì)大鯢性腺發(fā)育過(guò)程在組織學(xué)層面進(jìn)行了觀察，楊焱清等 （2003） 選用彩色多普勒儀檢測(cè)雌性大鯢卵徑的大小用來(lái)檢驗(yàn)其性腺發(fā)育整個(gè)過(guò)程，這些研究者的研究結(jié)果在一定程度上為探尋大鯢成熟情況提供了理論基礎(chǔ)，但也存在著局限性，如對(duì)親本會(huì)造成損傷、檢測(cè)準(zhǔn)確度不夠等。睪酮 （TT） 和雌二醇 （E2）是動(dòng)物體內(nèi)固有的2 種性激素，其功用是調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖行為，對(duì)確定動(dòng)物成熟度非常關(guān)鍵（汪小東等，2000；鄧?yán)龋?001；張利紅等，2001；何正侃等，2003）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鯢親本體內(nèi)睪酮和雌二醇含量的變化，旨在尋求大鯢成熟情況的有用檢測(cè)方式，為其規(guī)?；敝车旎碚摶A(chǔ)。

表1 E2檢測(cè)結(jié)果表

表2 T值檢測(cè)結(jié)果

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)大鯢親本為湖南億年酉魚公司自繁自養(yǎng)的二代親本，鯢齡為 2004年人工繁殖挑選培育且經(jīng)過(guò)連續(xù) 3 年以上人工催產(chǎn)繁殖，人絨毛膜促性腺激素 （HCG） ELISA 試劑盒、人雌二醇 （E2） ELISA 試劑盒和人睪酮（T） ELISA 試劑盒等試劑盒均購(gòu)買于上海銳聰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，檢測(cè)儀器為北京 DNM-9602 型酶標(biāo)分析儀。

2 樣品采集與測(cè)定

根據(jù)歷史繁殖資料抽取4組產(chǎn)卵產(chǎn)精效果好大鯢，4組產(chǎn)卵產(chǎn)精較差大鯢，和4組隨機(jī)抽取的大鯢，并于每月7～10日期間，于 8∶00 左右采集尿樣。操作時(shí)使親本大鯢的腹部朝上，然后用毛巾擦干或者吸干泄殖孔周圍的水漬，再用去掉針頭的10mL注射器插入泄殖孔內(nèi)1.0cm左右的深處，同時(shí)用手輕輕擠壓大鯢的腹部，收集尿液，采集后編號(hào)直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程和試劑說(shuō)明書進(jìn)行，同時(shí)此實(shí)驗(yàn)鯢在2014年人工催產(chǎn)中按原有技術(shù)體系進(jìn)行分類，并分不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行催產(chǎn)授精孵化，并對(duì)每一尾鯢所產(chǎn)卵與所授精卵進(jìn)行獨(dú)立的記錄和分區(qū)存放。

本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法（ELISA） 檢測(cè)大鯢尿液中雌二醇（E2） 和睪酮 （T） 這2種激素水平。酶聯(lián)免疫法的基本原理是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)定量檢測(cè)。具體來(lái)說(shuō)即將 E2 和 T 單克隆抗體包被于固相表面，再在固相抗體中加入要檢測(cè)的尿液，尿液中 E2 和 T與之接觸后，迅速形成抗原抗體復(fù)合物并附著于固相載體上，然后再加用辣根過(guò)氧化物接的 E2 和 T 抗體，再次形成抗體一抗原一酶聯(lián)抗體復(fù)合物，即雙抗體夾心復(fù)合物。洗去過(guò)量沒(méi)有結(jié)合的酶聯(lián)抗體，最后加人酶的作用底物與顯色劑，觀察顏色變化。反應(yīng)結(jié)果的顏色深淺與尿液HCG、E2 和 T濃度呈正比。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

E2 的檢測(cè)結(jié)果及檢測(cè)圖如表1所示。數(shù)據(jù)顯示大鯢尿液中E2值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區(qū)在5月時(shí)均值為33.5pmol/L，6月提高到了47.7pmol/L，7月時(shí)達(dá)到59.5pmol/L，7月下旬到8月上旬時(shí)達(dá)到頂峰均值為83.3ng/mL，隨后即開始下降分別為69.6pmol/L，54.7pmol/L，50pmol/L，并以41pmol/L進(jìn)入越冬期，且產(chǎn)后激素水平下降速度加快。通過(guò) 7月20日和 8 月 10 日兩次催產(chǎn)表明在 7 月底8 月初催產(chǎn)時(shí)效果最佳，催產(chǎn)率達(dá)到86%，且產(chǎn)卵量大，經(jīng)產(chǎn)順利，時(shí)間過(guò)早過(guò)遲產(chǎn)卵效果均比較差。

T值檢測(cè)結(jié)果及圖譜如表2所示。數(shù)據(jù)顯示大鯢尿液中T值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區(qū)在 5月時(shí)均值為 238.1pg/mL，6月均值為 281pg/ mL，7月時(shí)達(dá)到310.2pg/mL，8 月時(shí)達(dá)到頂峰360pg/mL，9月時(shí)開始明顯下降均值為214.5pg/mL，之后分別為190.3pg/mL，174pg/mL進(jìn)入越冬中。通過(guò)7月20日和 8月10日兩次催產(chǎn)在湖南地區(qū)氣候天7月底8月初是最佳的催產(chǎn)時(shí)間，但如在7月時(shí)其激素水平未能達(dá)到290pg/mL時(shí)，其基本催產(chǎn)不產(chǎn)精，且在300pg/mL左右時(shí)精子質(zhì)量也略顯差。

4 討論

4.1 雌二醇（E2）和睪酮（T）含量與時(shí)間變化

本次研究結(jié)果顯示，大鯢尿液中雌二醇和睪酮含量呈現(xiàn)出周期性變化，表現(xiàn)為在生殖季節(jié)前逐漸達(dá)到高峰，繁殖期過(guò)后逐漸降低到正常值，基本呈現(xiàn)出拋物線變化，高峰在 7 月下旬到 8 月中旬，且結(jié)果表明雌性大鯢峰值略早于雄鯢，此結(jié)果與很多研究結(jié)論基本一致（陽(yáng)愛(ài)生，1981；肖漢兵，1995；楊焱清，2003）。大鯢的雌二醇和睪酮含量達(dá)鼎盛時(shí)期后，不論是否進(jìn)行人工催產(chǎn)或者是否產(chǎn)卵產(chǎn)精，雌二醇和睪酮含量均會(huì)降低；這就不難看出，大鯢性腺發(fā)育是一個(gè)從生長(zhǎng)發(fā)育—成熟—退化—生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)相對(duì)固定、循環(huán)往復(fù)的生殖生理過(guò)程，達(dá)到性腺成熟的高峰是7 月中下旬。

4.2 雌二醇和睪酮含量與人工催產(chǎn)效果

當(dāng)在7月時(shí)雌二醇含量大于55.8 pmol/L時(shí)，雌性個(gè)體在外來(lái)激素的作用下，均可產(chǎn)卵，且產(chǎn)卵效果都較好，低于此值則可能不產(chǎn)卵，或產(chǎn)出空膠帶，但雄鯢性成熟E2臨界點(diǎn)暫不能準(zhǔn)確確定需下一步更準(zhǔn)確的研究對(duì)比。值得指出的是，當(dāng)E2含量＞90 pmol/L，若其含量繼續(xù)上升，選擇恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間催產(chǎn)不但會(huì)使催產(chǎn)效果好，并且受精率得到提高，若E2含量從最高點(diǎn)迅速減少，雖然能夠產(chǎn)出卵粒，但大多產(chǎn)卵不會(huì)順利，卵質(zhì)黃白相間，混濁，且受精率不高，甚至不能受精。雄性睪酮在7月時(shí)含量＞280pg/ mL時(shí)，在外來(lái)激素的作用下也均可產(chǎn)精，且精子活力與量均較好，但如含量在320pg/mL以上時(shí)建議最好安排7月催產(chǎn)不宜進(jìn)入8月，否則其產(chǎn)精效果明顯差，且死亡體，殘?bào)w精子多。大鯢人工催產(chǎn)試驗(yàn)還顯示，在19℃～21℃的水溫條件下，雄性大鯢催產(chǎn)效應(yīng)期過(guò)后能采到成熟精子的時(shí)間為3～5d，此時(shí)受精成功的機(jī)會(huì)最高，無(wú)論提前或超時(shí)其基本不授精，因此為確保大鯢人工繁殖成功，夏季水溫應(yīng)該盡量控制在 20℃以下為宜。

4.3 睪酮含量與副性征

副性征是生物體在繁殖期所表現(xiàn)出來(lái)的特有癥狀，雄性大鯢的副性征是生殖孔內(nèi)緣兩側(cè)有 2 排白色的小突起，成熟良好時(shí)，多數(shù)在生殖孔周圍出現(xiàn)“桔瓣?duì)睢钡墓饣∪饴∑鹑Γ橛邪c(diǎn)變紅或肛門四周皮膚泛紅等情況。本研究結(jié)果表明，凡具有雄性副性征的個(gè)體均能檢測(cè)到T值；不管雌鯢還是雄鯢，副性征越明顯，檢測(cè)出的TT 值越高。

5 結(jié)論

當(dāng)大鯢尿液中雌二醇（E2）值在90pmol/L時(shí)所產(chǎn)卵質(zhì)量最好，授精與產(chǎn)苗最高，雄鯢睪酮（T）值在280pg/ mL時(shí)精子活力最好授精與產(chǎn)苗最高。（參考文獻(xiàn)略）