■楊　柳　張　一　陳宇飛

（吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春　130507）

一株用于微生態(tài)飼料發(fā)酵劑的乳酸菌篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

■楊柳張一陳宇飛

（吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

對(duì)用于微生態(tài)飼料發(fā)酵劑的乳酸菌進(jìn)行篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化。測(cè)定了3種乳酸菌的產(chǎn)酸速度，進(jìn)行了大腸桿菌的抑菌效果試驗(yàn)，并利用梅里埃細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)優(yōu)良菌種進(jìn)行鑒定，得出A型乳酸菌的產(chǎn)酸速度快、抑菌效果好，并鑒定該菌為戊糖片球菌；通過(guò)研究培養(yǎng)條件諸因素對(duì)乳酸菌生物量的影響，研究得出：培養(yǎng)溫度30℃、靜置培養(yǎng)、接種量1%、氮源選擇蛋白胨、碳源濃度為8%～10%、初始pH值為6.5，該條件下乳酸菌的生物量最大。為微生物飼料發(fā)酵劑菌種的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論參考。

微生態(tài)；發(fā)酵劑；乳酸菌；生物量；篩選；優(yōu)化

乳酸菌是一種存在于生物體內(nèi)的益生菌，它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價(jià)，降低血清膽固醇等作用。目前，許多學(xué)者都對(duì)乳酸菌做了深入的研究。

乳酸菌篩選方面，楊亞晉等從自然生物環(huán)境中篩選產(chǎn)高效抑菌蛋白的乳酸菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化、糖發(fā)酵（API）和16SrDNA基因序列同源性分析進(jìn)行菌種鑒定；張慧杰等從苜蓿、玉米、青貯飼料中分離得到5株乳酸菌，通過(guò)產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)篩選出產(chǎn)酸較快、生長(zhǎng)迅速的菌株作為制備乳酸菌青貯飼料添加劑的優(yōu)良菌株。

乳酸菌優(yōu)化方面，侯霞霞等對(duì)篩選出的優(yōu)良菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)溫度范圍、酸堿耐受性和耐鹽性；尹望等

對(duì)一株豬源乳酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究其對(duì)膽鹽及酸性環(huán)境的耐受性，得出相同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，活菌數(shù)越低；洪梅等對(duì)采集自德國(guó)青貯窖中主導(dǎo)菌群中一株乳酸菌GLP01進(jìn)行了分子學(xué)鑒定， 并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。飼料發(fā)酵劑應(yīng)用方面，楊艷等以紫花苜蓿為材料，以5株乳酸菌為添加劑，測(cè)定苜蓿料化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及各因素間的相關(guān)性；朱雯等采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究乳酸菌、米糠和水分添加量對(duì)青貯茭白鞘葉質(zhì)量的影響。得出乳酸菌的添加顯著提高了青貯品質(zhì)，利于提高青貯發(fā)酵的有氧穩(wěn)定性。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室3株乳酸菌進(jìn)行篩選后，根據(jù)產(chǎn)酸速度和抑菌效果，確定A型菌為優(yōu)良菌種。采用細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，A型菌鑒定為為戊糖片球菌，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為與其他菌種復(fù)配，生產(chǎn)出更加優(yōu)良的微生態(tài)飼料發(fā)酵劑提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

A型乳酸菌、B型乳酸菌、C型：乳酸菌、大腸桿菌。保存于吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.3主要儀器設(shè)備

IBE5000I型顯微鏡，重慶光學(xué)儀器有限公司；TGL16A型離心機(jī)，上海趙迪生物科技有限公司；PHSJ-4F精密pH計(jì)，上海上天精密儀器有限公司；BCD-252KSF冰箱，青島海爾集團(tuán)公司；SHA-BA恒溫振蕩器，上海世平集團(tuán)有限公司；SPX-250A-Z型培養(yǎng)箱，上海市百典儀器廠；R206D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；101-2型干燥箱，上海安競(jìng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CP214型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YXQ.SG46-280S型高壓滅菌鍋，西化儀（北京）科技有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰。

1.2方法

1.2.1pH值檢測(cè)

將3種乳酸菌分別接入培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)震蕩器中培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定1次，每次做3個(gè)平行樣本試驗(yàn)，共測(cè)12次。

1.2.2抑菌率的測(cè)定

菌餅的制備：將大腸桿菌活化后接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，制成直徑4 mm的菌餅，放在4℃冰箱中，備用。

抑菌率計(jì)算：將菌餅放入含濃度200 mg/ml乳酸菌的培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)，48 h后采用十字交叉法，測(cè)定抑菌率。

式中：M——抑菌率（%）；

A——對(duì)照菌生長(zhǎng)量（mm）；

C——處理菌生長(zhǎng)量（mm）。

1.2.3菌種鑒定

利用梅里埃細(xì)菌半自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。具體如下：

乳酸菌在固體平板畫(huà)線分離，35℃恒溫培養(yǎng)48 h，反復(fù)畫(huà)線分離三次，分出單個(gè)菌落，接入細(xì)菌半自動(dòng)鑒定系統(tǒng)API試劑條進(jìn)行檢測(cè)，35℃恒溫培養(yǎng)48 h后系統(tǒng)測(cè)定。

1.2.4培養(yǎng)條件的優(yōu)化

先將溫度定位35℃、搖瓶轉(zhuǎn)速100 r/min、接種量1%、氮源為蛋白胨、葡萄糖濃度8%、初始pH值7.0，分別測(cè)定溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量、氮源種類、碳源濃度、初始pH值對(duì)乳酸菌生物量的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種篩選結(jié)果

圖1　乳酸菌培養(yǎng)時(shí)間與pH值的關(guān)系

2.1.1菌種產(chǎn)酸速度由圖1可知：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，pH值都呈下降趨勢(shì)。A型乳酸菌在0～8 h期間pH值下降較快，8～12 h下降較為平緩，12 h達(dá)到最低值，約4.5左右。B型乳酸菌和C型乳酸菌下降較為緩慢，分別在20 h和24 h下降到最低值5.0左右。可見(jiàn)，A型乳酸菌產(chǎn)酸速度較快，適合作微生態(tài)飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵菌種。

2.1.2菌種抑菌效果

圖2　乳酸菌的抑菌效果

由圖2可知：A型乳酸菌抑制大腸桿菌的能力較強(qiáng)，抑菌率達(dá)到92%，B型乳酸菌的抑菌能力略低，而C型乳酸菌的抑菌率只有15%，說(shuō)明A型乳酸菌、B型乳酸菌具有較好的抑菌能力，可用于飼料發(fā)酵劑中抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

2.1.3菌種鑒定結(jié)果

A型乳酸菌通過(guò)梅里埃半自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)檢測(cè)，鑒定為戊糖片球菌，其鑒定%ID值為99.6，T值為0.84。%ID值為鑒定百分率，是每個(gè)細(xì)菌條目生化反應(yīng)的出現(xiàn)概率值與該細(xì)菌條目所在分類菌群中的所有細(xì)菌條目生化反應(yīng)出現(xiàn)概率值總和的比值。即表示的是每種細(xì)菌出現(xiàn)的可能性；T值為某細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率除以該細(xì)菌條目最典型菌的總出現(xiàn)頻率得到的值。T值代表的是個(gè)體相較于最普遍情況的近似性。%ID和T值均較接近1，因此，具有極高的可信度。

2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1溫度對(duì)乳酸菌生物量的影響

圖3　溫度對(duì)乳酸菌生物量的影響

由圖3可知：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，曲線呈上升趨勢(shì)，生物量逐漸增加；14 h之后，曲線趨于平穩(wěn)，說(shuō)明此時(shí)已進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的末期。培養(yǎng)時(shí)間在8 h之內(nèi)，除了在25℃培養(yǎng)條件下生物量較低以外，35、37℃下的生物量增加速度高于30℃培養(yǎng)條件下的生物量。說(shuō)明微生物的生長(zhǎng)繁殖受溫度影響較大，高溫促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)間大于10 h之后，30℃培養(yǎng)條件下生物量增長(zhǎng)速度加快，最高值為12.8 g/l，說(shuō)明30℃是該乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度。

2.2.2搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)乳酸菌生物量的影響

圖4　搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)乳酸菌生物量的影響

由圖4可知：兩種條件下培養(yǎng)的乳酸菌曲線形態(tài)相似，生物量差別不大，即乳酸菌在培養(yǎng)過(guò)程中不需要搖瓶震蕩培養(yǎng)。搖瓶震蕩培養(yǎng)的目的是為了生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞均勻分布，增加溶氧量，以便使細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程保持充足的氧氣。說(shuō)明了該種乳酸菌為兼性厭氧微生物，培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需增加氧氣，可以靜止培養(yǎng)。

2.2.3接種量對(duì)乳酸菌生物量的影響

圖5　接種量對(duì)乳酸菌生物量的影響

由圖5可知：接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)量的影響是階段性的差異。即接種量對(duì)最高生物量無(wú)影響，但達(dá)到最高生物量的時(shí)間，即生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期末期時(shí)間有差異。較高濃度的接種量進(jìn)入對(duì)數(shù)期末期的時(shí)間更短，考慮生產(chǎn)成本，選擇1%的接種量較為理想。

圖6　氮源種類對(duì)乳酸菌生物量的影響

2.2.4氮源種類對(duì)乳酸菌生物量的影響由圖6可知：氮源種類對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)量的影響較大，乳酸菌利用硝酸鹽、銨鹽的能力較差，蛋白胨和酵母膏較大地促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)。酵母膏可能含有

B族維生素，對(duì)乳酸菌具有刺激作用，蛋白胨是天然的有機(jī)含氮化合物，成分中含有少量的生長(zhǎng)因子，對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有利。因此，乳酸菌利用有機(jī)氮的能力較強(qiáng)，從成本考慮選擇蛋白胨作為氮源。

2.2.5碳源濃度對(duì)乳酸菌生物量的影響

圖7　碳源濃度對(duì)乳酸菌生物量的影響

由圖7可知：葡萄糖濃度對(duì)乳酸菌生物量影響不大，呈現(xiàn)先增高、后降低的趨勢(shì)。碳源是微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，碳源不足，微生物生長(zhǎng)受阻，碳源過(guò)多，微生物內(nèi)含量過(guò)多，同樣影響微生物的生長(zhǎng)。因此，8%～10%的碳源含量有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。

2.2.6初始pH值對(duì)乳酸菌生物量的影響

圖8　初始pH值對(duì)乳酸菌生物量的影響

由圖8可知：隨著pH值的升高，乳酸菌的生物量逐漸增加，當(dāng)pH值＞7時(shí)，略有下降，說(shuō)明該乳酸菌的最適pH值范圍是6.5～7.0，。即該乳酸菌適合中性偏酸的環(huán)境，與酵母等真菌生活環(huán)境相近，這為多菌混合研究微生態(tài)飼料發(fā)酵劑提供方便，因此，選pH值6.5為佳。

3　結(jié)論

本文研究了A型、B型、C型乳酸菌的菌種篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。進(jìn)行了3種乳酸菌產(chǎn)酸試驗(yàn)、大腸桿菌抑菌試驗(yàn)、菌種鑒定試驗(yàn)。結(jié)果得出：A型乳酸菌產(chǎn)酸速度明顯高于B型和C型，從抑菌效果來(lái)看，A型和B型乳酸菌抑菌效果較好。綜合考慮，選擇A型乳酸菌作為微生態(tài)飼料發(fā)酵劑的菌種，利用梅里埃細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)優(yōu)良菌種進(jìn)行鑒定，鑒定該菌為戊糖片球菌。

在培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)中，分別作了溫度、搖瓶震蕩、接種量、氮源種類、碳源濃度、初始pH值等因素對(duì)乳酸菌生物量的影響試驗(yàn)，得出：培養(yǎng)溫度為30℃、靜止培養(yǎng)、接種量為10%、氮源種類選擇蛋白胨、碳源濃度為8%～10%、初始pH值為6.5，該條件下獲得的乳酸菌生物量最大。

本文不足之處是只研究了一種乳酸菌的培養(yǎng)條件，菌種單一、功能有限，需進(jìn)一步研究該種乳酸菌與酵母、芽孢桿菌等復(fù)配的最佳培養(yǎng)條件，為研究開(kāi)發(fā)多菌混合微生態(tài)飼料發(fā)酵劑提供理論參考。

Screening of a micro-ecological fodder starter culture lactic acid bacterial strain and optimization of culture conditions

Yang Liu，Zhang Yi，Chen Yufei

A micro-ecological fodder starter culture lactic acid bacterial strain was screened and the culture conditions were optimized in this article.The acid production rate of three kinds of lactic acid bacteria was determined，and the antibacterial test for e.coli was carried out.Meanwhilethe excellent strains were identified by using French bacteria identification system.The result shows that the acid production rate of type A lactic acid bacteria was fast，with good antibacterial effect.And the type A lactic acid bacteria was identified asPediococcus pentosus.By studying the effect of each culture condition on biomass of lactic acid bacteria，we reached that the culture temperature was 30℃，stilling culture，inoculum size was 1%，choosing peptone as nitrogen source with the concentration of 8%～10%，the initial pH was 6.5.Under this condition，the biomass of lactic acid bacteria was the highest. These provided a theoretical reference for development and application of micro-ecological fodder starter culture strains.

micro-ecology；starter culture；lactic acid bacteria；biomass；screening；optimization

（12篇，刊略，需者可函索）（編輯：王芳，xfang2005@163.com）

10.13302/j.cnki.fi.2016.05.008

S816.32

A

1001-991X（2016）05-0035-04

楊柳，副教授，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工、微生物學(xué)。

陳宇飛，教授。

2015-11-09