楊 瑩 倪娜娜 王光平 溫斯健 宋 昊 崔盤根 孫建方

論 著

CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14生物學(xué)行為的影響

楊 瑩 倪娜娜 王光平 溫斯健 宋 昊 崔盤根 孫建方

目的： 明確CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14體外增殖、遷移、侵襲的影響。方法： 用不同濃度的CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）刺激或誘導(dǎo)人黑素瘤細(xì)胞株M14，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell遷移和侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。用100 ng/mL的CXCL12處理人黑素瘤細(xì)胞株M14，Western blot法檢測(cè)處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達(dá)。結(jié)果： CXCL12能夠增強(qiáng)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，以及促進(jìn)ERK、AKT信號(hào)通路的激活。結(jié)論： CXCL12可能與黑素瘤的進(jìn)展過(guò)程相關(guān)。

黑色素瘤； CXCL12； 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為

趨化因子CXCL12（C-X-C motif chemokine ligand 12，又名stromal cell derived factor-1，SDF-1）是趨化因子受體 CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4）和CXCR7（C-X-C chemokine receptor type 7）的共同配體，其所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物軸及CXCL12/CXCR7生物軸近年來(lái)被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［1］。我們?cè)谇捌诘难芯恐欣肦ealtime PCR和Western blot法檢測(cè)CXCR4和 CXCR7在人黑素瘤細(xì)胞株 A375、M14、 MV3的表達(dá)，基于試驗(yàn)結(jié)果，選擇CXCR4和CXCR7表達(dá)最高的人黑素瘤細(xì)胞株M14作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。因此，本研究以體外培養(yǎng)的人黑素瘤細(xì)胞株M14作為主要實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，觀察CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人p-ERK多克隆抗體、鼠抗人ERK單克隆抗體、兔抗人p-AKT多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、鼠抗人Actin單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，重組人 CXCL12/SDF-1α購(gòu)自R&D Systems，CCK8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，Matrigel購(gòu)自BD Biosciences。細(xì)胞：人黑素瘤細(xì)胞株M14由本所研究生饋贈(zèng)，培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK8法 實(shí)驗(yàn)根據(jù)CXCL12的藥物濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）分為5組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×103個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后加入10 μL不同濃度的CXCL12，調(diào)整藥物終濃度為0、10、50、100、200 ng/mL，第24 h、48 h、72 h分別取出，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm的OD值，記錄結(jié)果。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 Transwell遷移及侵襲試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)根據(jù)下室加入的CXCL12藥物濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）分為5組。Transwell遷移與侵襲試驗(yàn)的區(qū)別在于Transwell侵襲試驗(yàn)小室使用前上室面需要鋪膠，實(shí)驗(yàn)使用的Matrigel按1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，其余步驟相同。細(xì)胞撤血清饑餓16 h，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，每上室加入200 μL含1%FBS的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后的細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含不同濃度CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）的10%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，0.1%結(jié)晶紫染色，200×高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot法 按總蛋白提取試劑說(shuō)明書提取人黑素瘤細(xì)胞株M14的總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，每泳道取等量蛋白60 μg上樣后電泳，先80 V電壓跑上膠30 min，再改用120 V跑下膠90 min，切膠轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗ERK（1∶500）、p-ERK（1∶500）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶500）后4℃過(guò)夜，次日室溫再孵育 30 min后加入熒光二抗（1∶5000 IRDye800CW donkey anti-Rabbit IgG或 1∶5000 IRDye800CW donkey anti-mouse IgG），使用美國(guó)LICOR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)顯色成像，保存圖片。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism6.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組以上數(shù)據(jù)比較采用方差分析后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的再用Boneferroni檢驗(yàn)對(duì)每?jī)山M數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均設(shè)為α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞增殖能力的影響 不同濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12作用于人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞24、48、72 h后，利用CCK8法檢測(cè)人黑素瘤細(xì)胞株M14的細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，10、50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能刺激人黑素瘤細(xì)胞株M14的細(xì)胞增殖，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)劑量依賴的現(xiàn)象，即藥物濃度越高，促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力越強(qiáng)，但第72 h時(shí)間點(diǎn)，100 ng/mL與200 ng/mL濃度的組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯意義，除圖中所標(biāo)示的組（P＞0.05），其余組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 不同濃度的CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞體外遷移及侵襲能力的影響 利用Transwell遷移及侵襲試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12誘導(dǎo)后的人黑素瘤細(xì)胞株M14的細(xì)胞遷移及侵襲能力（圖2、3）。結(jié)果顯示，10、50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能誘導(dǎo)人黑素瘤細(xì)胞株M14的細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)，且隨著濃度的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的能力越強(qiáng)，但100 ng/mL與200 ng/mL濃度的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50、100、200 ng/mL濃度的CXCL12均能誘導(dǎo)人黑素瘤細(xì)胞株M14的細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)，且隨著濃度的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲的能力越強(qiáng)，但10 ng/mL濃度與0 ng/mL濃度的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

2.3 CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞p-ERK、p -AKT表達(dá)水平的影響 實(shí)驗(yàn)分為6組，基于CCK8法、Transwell遷移及侵襲試驗(yàn)的結(jié)果，我們選擇以100 ng/mL濃度的CXCL12處理人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞，利用Western blot法檢測(cè)處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達(dá)，分別以ERK、AKT的表達(dá)量作為對(duì)照，計(jì)算p-ERK、p-AKT的相對(duì)表達(dá)量（圖5）。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)的p-ERK、p-AKT的相對(duì)表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異（P＜0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ERK、AKT的磷酸化增加，從而使得相關(guān)的ERK、AKT信號(hào)通路過(guò)度活化，100 ng/mL的CXCL12可以促進(jìn)ERK、AKT信號(hào)通路的活化。但是，p-ERK的相對(duì)表達(dá)量在處理后20 min和30 min之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-AKT的相對(duì)表達(dá)量在處理后10 min達(dá)到最大值，其后一直保持在高水平，與處理后的20 min、30 min、60 min的相對(duì)表達(dá)量比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異（圖6）。

圖2 Transwell遷移（×200）

圖3 Transwell侵襲（×200）

圖4 CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞體外遷移（4a）及侵襲（4b）能力的影響

圖5 利用Western blot法檢測(cè)處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、20、30、60 min）的 ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表達(dá) 圖6 CXCL12對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞p-ERK（6a）、p-AKT（6b）相對(duì)表達(dá)水平的影響

3 討論

黑素瘤（Melanoma，MM）是惡性程度極高的腫瘤，好發(fā)于皮膚，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅有14%［2］。研究表明，趨化因子受體與黑素瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，譬如趨化因子受體CCR7能促進(jìn)黑素瘤轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，趨化因子受體CCR10可增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞侵襲宿主的能力及促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。

CXCL12是趨化因子受體CXCR4和CXCR7的共同配體，包括SDF-1α和β兩種異構(gòu)體，屬于趨化因子CXC亞家族。其所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物軸及CXCL12/CXCR7生物軸能促進(jìn)多種腫瘤的進(jìn)展，被認(rèn)為有望成為腫瘤靶向治療的新途徑［1］。ERK、AKT信號(hào)通路激活參與多種腫瘤的形成及進(jìn)展，包括在黑素瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲中發(fā)揮重要作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體通過(guò)激活ERK、AKT信號(hào)通路從而發(fā)揮作用，如 CXCR4/CXCL12生物軸可激活ERK通路并促進(jìn)前列腺癌的血管生成［5］，CXCR7/CXCL12生物軸也可激活 ERK、AKT通路增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖及趨化能力［6］。

目前的研究對(duì)趨化因子受體CXCR4、CXCR7在黑素瘤進(jìn)展中的作用存在不同意見，部分研究認(rèn)為CXCR4在黑素瘤進(jìn)展中起重要作用［7-10］，少數(shù)研究認(rèn)為促進(jìn)黑素瘤進(jìn)展的是CXCR7而不是CXCR4［11］。雖然存在爭(zhēng)議，但是CXCL12作為CXCR4、CXCR7受體的共同配體，其對(duì)黑素瘤進(jìn)展的作用值得我們研究。Mori等［12］研究表明，CXCL12在50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL濃度下均能刺激胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲，但效果最強(qiáng)的濃度是100 ng/ mL。Lechertier等［13］研究表明，CXCL12在10 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL濃度下均能刺激MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移，且隨著CXCL12濃度的升高，遷移能力也增強(qiáng)，這種作用受到其受體CXCR4的調(diào)節(jié)。Yamada等［14］研究顯示，CXCL12在100 ng/mL濃度下可增強(qiáng)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，且可激活ERK信號(hào)通路。Lee等［15］研究顯示，CXCL12在50 ng/mL、200 ng/mL的濃度下能夠誘導(dǎo)正常人表皮黑素細(xì)胞的遷移，50 ng/mL濃度的CXCL12即可激活ERK信號(hào)通路。

基于以上文獻(xiàn)，我們?cè)O(shè)置了CXCL12的5個(gè)濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）進(jìn)行試驗(yàn)分組。研究結(jié)果顯示，10、50、100、200 ng/mL的CXCL12均能增強(qiáng)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞的增殖能力、遷移能力，而50、100、200 ng/mL的CXCL12能增強(qiáng)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞的侵襲能力，且隨著濃度的增加，其促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用更加明顯。但是，第72 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)的100 ng/mL與200 ng/mL的CXCL12對(duì)細(xì)胞增殖的影響組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且100 ng/ mL與200 ng/mL的CXCL12誘導(dǎo)遷移的細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。而且，我們發(fā)現(xiàn)100 ng/mL的CXCL12具有促進(jìn)ERK、AKT信號(hào)通路激活的效果。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，CXCL12能夠增強(qiáng)人黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，以及促進(jìn)ERK、AKT信號(hào)通路的激活，提示CXCL12可能與黑素瘤的進(jìn)展過(guò)程相關(guān)，為后續(xù)研究CXCL12/CXCR4生物軸、CXCL12/CXCR7生物軸在黑素瘤進(jìn)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿：2016-03-09 修回：2016-04-11）

Effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line

YANG Ying，NI Nana，WANG Guangping，WEN Sijian，SONG Hao，CUI Pangen，SUN Jianfang.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China
Corresponding author：SUN Jianfang，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

Objective：To investigate the effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line.Methods：The human melanoma M14 cell line was incubated or induced by different concentrations of CXCL12（0，10，50，100，200 ng/mL）.The Cell Counting Kit-8（CCK8），transwell migration and invasion assay were used to evaluate the proliferation，migration，and invasion of M14 cells.The Western blot was used to detect the protein expression of ERK，p-ERK，AKT，and p-AKT of M14 cells treated with 100 ng/mL CXCL12 at different times（0，5，10，20，30，60 min）.Results：CXCL12 promoted the proliferation，migration and invasion of M14 cells，and the activation of the ERK and AKT signaling pathways. Conclusion：CXCL12 may be associated with the progression of melanoma.

melanoma；CXCL12；tumor cell biological behavior

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金

（編號(hào)：20141002310023005）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81171513）

2012高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金

（編號(hào)：20121106110040）

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042

孫建方，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

［12］Mori T，R，Koizumi M，et al.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Ther，2004，3（1）：29-37.