蔡智慧，尹　麗，常全忠

梔子苷預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響及機(jī)制研究*

蔡智慧，尹麗，常全忠

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，漯河462002）

［目的］探討梔子苷預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響及機(jī)制。［方法］體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，制備缺氧/復(fù)氧損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，缺氧/復(fù)氧模型組，梔子苷預(yù)處理組。分光光度法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量以及過氧化物歧化酶（SOD）活性，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞存活率，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率。［結(jié)果］與模型組比較，梔子苷預(yù)處理組能明顯減少心肌細(xì)胞CK、LDH的漏出量，提高SOD活力，降低MDA含量，同時(shí)提高心肌細(xì)胞的存活率，減少心肌細(xì)胞的凋亡。［結(jié)論］梔子苷預(yù)處理對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌抗氧化能力、清除氧自由基以及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

梔子苷；心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷

梔子苷（GE）是從茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)中提取出來的一種環(huán)烯醚萜苷類化合物［1］，具有多種藥理作用。近年來，眾多動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)梔子苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱消毒等藥效，是治療心腦血管、肝膽以及神經(jīng)疾病等的原料藥物［2］。但是，關(guān)于梔子苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的作用目前研究的不多，因此本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察梔子苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響，以及對(duì)心肌細(xì)胞存活率和凋亡的影響，為中藥在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　材料和方法

1.1細(xì)胞株H9C2心肌細(xì)胞株購于北京中醫(yī)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2主要儀器和試劑二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（Thermo公司），倒置熒光顯微鏡（Olympus公司），分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Multiskan FC酶標(biāo)儀（Thermo公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），梔子苷（中國藥品生物制品檢定所），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM培養(yǎng)基（Solarbio公司），LDH、CK、SOD和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Sigma公司），其余試劑均為分析純。

1.3缺氧/復(fù)氧模型制備參考文獻(xiàn)方法并進(jìn)行改進(jìn)。取對(duì)數(shù)生長期的心肌細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長至80%融合狀態(tài)時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，加入不含F(xiàn)BS的無糖培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板放入通有95%氮?dú)猓∟2）和5%CO2混合氣體的缺氧盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)4 h，然后換成正常培養(yǎng)基在常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組：1）正常對(duì)照組：加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)。2）缺氧/復(fù)氧模型組：缺氧4 h，復(fù)氧12 h，具體造模方法同上。3）梔子苷預(yù)處理組：造模前2 h加入用正常培養(yǎng)液配制的梔子苷，其余處理同缺氧/復(fù)氧模型組。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、SOD、MDA的測定缺氧/復(fù)氧模型建立成功后，按照試劑盒提供的方法取心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用分光光度法測定上清液中LDH、CK、SOD、MDA的含量。

1.6MTT法檢測心肌細(xì)胞存活率造模結(jié)束后棄上清，每孔加入MTT10 μL，DMEM培養(yǎng)基90 μL，共孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分震蕩，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度。以不含細(xì)胞，只含培養(yǎng)基和MTT的孔為本底對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組-OD本底對(duì)照組）/（OD正常對(duì)照組-OD本底對(duì)照組）×100%

1.7采用流式細(xì)胞方法檢測細(xì)胞凋亡率造模結(jié)束后將心肌細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶進(jìn)行消化，再用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，4℃1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC 10 μL和PI 5 μL混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)液LDH、CK、SOD、MDA的測定如表1所示，模型組心肌細(xì)胞生成LDH、CK、MDA較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），SOD活性則較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，梔子苷可使LDH、CK、MDA減少（P＜0.01），SOD活性升高（P＜0.05）。結(jié)果說明梔子苷可以提高心肌細(xì)胞的抗氧化以及清除氧自由基的能力，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，減少心肌酶的漏出。

表1　梔子苷對(duì)LDH、CK、SOD、MDA的含量的影響（x±s）Tab.1　Effects of geniposide to the contents of LDH，CK，SOD and MDA

表1　梔子苷對(duì)LDH、CK、SOD、MDA的含量的影響（x±s）Tab.1　Effects of geniposide to the contents of LDH，CK，SOD and MDA

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組　n　LDH　CK　SOD　MDA（U/L）　?。║/L）?。↘N U/L）（μmol/L）正常對(duì)照組　8 24.26±5.37　15.23±4.52 46.55±7.84 1.57±0.52模型組　842.96±6.82**29.35±6.54**29.23±5.48**5.69±0.86**梔子苷預(yù)處理組 8 32.53±6.19##23.21±4.97##35.63±5.78#2.97±0.65##

2.2心肌細(xì)胞存活率的測定如表2所示，模型組心肌細(xì)胞存活率明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01），與模型組相比，梔子苷預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率則明顯提高（P＜0.01）。結(jié)果說明，梔子苷可以提高缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的存活率，起到保護(hù)作用。

表2　梔子苷對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響（x±s）Tab.2　Effects of geniposide to cell viability of myocardial cells

表2　梔子苷對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響（x±s）Tab.2　Effects of geniposide to cell viability of myocardial cells

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

分組　n　OD490 nm　　存活率（%）正常對(duì)照組　8　0.356±0.136　100.0±0模型組　8　0.178±0.045**　48.5±3.3**梔子苷預(yù)處理組　8　0.289±0.047##　80.2±5.9##

2.3心肌細(xì)胞凋亡的測定流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、模型組、梔子苷預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率分別為1.2%，55.8%，15.3%。與正常對(duì)照組比較，模型組凋亡率顯著增加。與模型組相比，梔子苷預(yù)處理組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。說明梔子苷能顯著抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果見圖1。

3　討論

近年來，溶栓、PTCA等技術(shù)愈發(fā)成熟，然而缺血再灌注損傷的問題一直沒有得到有效解決，成為缺血性心臟病治療過程中的難題［4］。心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，目前公認(rèn)的主要有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、細(xì)胞凋亡等［5］。

正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在著少量的自由基，可以被SOD及時(shí)清除，當(dāng)缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，SOD活性受到抑制，導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生，與細(xì)胞膜及生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng)［6-7］。MDA是心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，大量的MDA破壞了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)的心肌酶LDH、CK發(fā)生外漏。因此檢測SOD活性及LDH、CK和MDA的含量可以間接反映細(xì)胞膜受損傷的程度［8］。

圖1　梔子苷對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.1　Effects of geniposide to the apoptosis of myocardial cells

梔子苷是從傳統(tǒng)中藥梔子中提取出來的一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱消毒、保肝利膽等多種藥理作用［9］。近年來，眾多動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)梔子苷具有心血管保護(hù)作用［10-11］，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，用缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型模擬體外心肌缺血/再灌注，結(jié)果顯示，與模型組相比，梔子苷預(yù)處理組SOD活性升高，LDH、CK以及MDA的含量減少。同時(shí)，MTT的結(jié)果顯示，梔子苷組心肌細(xì)胞的存活率明顯高于模型組，說明梔子苷可以提高機(jī)體清除氧自由基以及抗氧化能力，保護(hù)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞。

此外，心肌細(xì)胞在發(fā)生缺血再灌注的過程中，細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基的大量增多以及中性粒細(xì)胞的浸潤等都會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡［12］。近年來，眾多研究者證實(shí)心肌細(xì)胞的凋亡是心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生過程中的一個(gè)重要事件，有效干預(yù)心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)于防治心肌缺血再灌注損傷有著重要的意義［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的心肌細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組，這和其他研究者的結(jié)果相一致，而進(jìn)行梔子苷預(yù)處理則可以明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，梔子苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與梔子苷能增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化能力，清除氧自由基以及減少心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Effects and mechanism of geniposide pretreatment on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury

CAI Zhi-hui，YIN Li，CHANG Quan-zhong
（Department of Basic Medicine，Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

［Objective］To explore the effects and mechanism of geniposide pretreatment on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/ reoxygenation injury.［Methods］H9C2 cardiomyocytes were cultivated in vitro and the model of hypoxia/reoxygenation injury was established.The cells were randomly divided into 3 groups:the control group，hypoxia/reoxygenation injury group and the geniposide pretreatment group.The contents of CK，LDH，MDA and the activity of SOD were evaluated by spectrophotometric method.The cell viability was measured with MTT.The apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC/PI staining.［Results］Compared with the hypoxia/ reoxygenation injury group，the geniposide pretreatment group can reduce the concentration of CK，LDH and MDA，improve the activity of SOD in myocardial tissue，improve the cell viability and reduce the apoptosis rate.［Conclusion］The geniposide has protective effects on hypoxia/reoxygenation injury，which are associated with scavenging free radical，enhancing the capacity of antioxidation and inhibiting cadioocyte apoptosis.

geniposide；cardiomyocyte；hypoxia/reoxygenation injury

R285.5

A

1672-1519（2016）02-0111-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.13

河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A180031）。

蔡智慧（1983-），女，碩士，講師，主要從事生理學(xué)教學(xué)和科研工作。

常全忠，E-mail：cqzchang@tom.com。

（2015-10-21）