趙　強(qiáng)，王一洲

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伸筋易骨矯形手法對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝及Sox9表達(dá)的影響*

趙強(qiáng)，王一洲

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院推拿科，天津300120）

［目的］探討伸筋易骨矯形手法對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝及Sox9表達(dá)的影響。［方法］將膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）模型兔隨機(jī)分為3組，治療組采用伸筋易骨矯形手法治療，對(duì)照組采用關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉治療，模型組不做干預(yù)，同條件飼養(yǎng)，取材后分離膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，鏡下觀察并通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MMT）對(duì)比3組軟骨細(xì)胞增殖情況；通過蛋白免疫印跡分析3組軟骨細(xì)胞Sox9的表達(dá)變化。［結(jié)果］鏡下觀察治療組、對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨的增殖速度均快于空白組，其中治療組增殖速度最快，MMT法檢測(cè)治療組軟骨細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組（P＜0.05），蛋白免疫印跡分析顯示治療組Sox9表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05）。［結(jié)論］伸筋易骨矯形手法具有提高軟骨細(xì)胞增殖速度，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖能力，同時(shí)該手法可以提高損傷軟骨組織Sox9的表達(dá)水平，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成代謝。

伸筋易骨矯形手法；膝關(guān)節(jié)；軟骨細(xì)胞代謝；Sox9

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨損害為特征的退行性骨關(guān)節(jié)病，雖然KOA發(fā)病機(jī)制的許多細(xì)節(jié)仍不明確，但大量研究顯示KOA的病情發(fā)展與軟骨細(xì)胞分解和合成代謝的失調(diào)相關(guān)。Sox9基因是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，可以介導(dǎo)并參與多條信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化［1］，Sox9基因的作用貫穿KOA的整個(gè)病程，是緩解軟骨退變和促進(jìn)軟骨修復(fù)的關(guān)鍵基因。

臨床研究顯示伸筋易骨矯形手法可以調(diào)節(jié)KOA患者膝關(guān)節(jié)周圍軟組織功能、緩解臨床癥狀，因此本實(shí)驗(yàn)以伸筋易骨矯形手法治療KOA模型兔，對(duì)比臨床常用的關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉，研究該手法對(duì)Sox9基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，驗(yàn)證其促進(jìn)軟骨組織修復(fù)的作用機(jī)制，為臨床提供安全有效的治療手法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司，美國）、二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁公司，中國）、Sox9抗體（Abcam公司，美國）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司，中國）、組織和細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（江萊公司，中國）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（碧云天公司，中國）、辣根過氧化物標(biāo)記二抗（Jackson公司，美國）。

1.2儀器酶標(biāo)分析儀（BioTek公司，美國）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本）、超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）、電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Uvitec公司，英國）。

1.3模型采用改良Hulth模型構(gòu)建30只KOA兔模型［北京維通利華SCXK（京）05076685］，健康6～8月齡，體質(zhì)量3～3.5 kg，雌雄各半，將30只兔編號(hào)后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成3組，治療組采用伸筋易骨矯形手法治療，對(duì)照組采用關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液治療，模型組造模后同條件、同期飼養(yǎng)。

Hulth模型制作方法［2］：右側(cè)后腿上方靠近尾部備皮，3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定下肢，從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開2 cm顯露膝關(guān)節(jié)，將髕骨推向外側(cè)，牽開關(guān)節(jié)暴露前交叉韌帶并切斷，同時(shí)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，縫合皮膚和皮下組織，沖洗關(guān)節(jié)腔，術(shù)后給予口服止痛藥及抗生素，1周后開始驅(qū)趕每日0.5 h，連續(xù)30 d。

1.4治療方法治療組［3］：1）將造模后的兔仰臥位固定，指揉股四頭肌，髕骨周圍，約5 min，按揉鶴頂、血海、梁丘、伏兔等穴，每穴1 min。2）彈撥髕韌帶、髂脛束、股四頭肌肌腱附著處，并提拿髕骨。3）膝關(guān)節(jié)搖法1 min，配合被動(dòng)屈伸。4）擦法1 min，結(jié)束手法。以上手法治療每日1次，7 d為1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程。對(duì)照組：1）仰臥位固定下肢，常規(guī)消毒。2）髕骨外側(cè)緣下方凹陷處進(jìn)針注入玻璃酸鈉（每只5 mg，相當(dāng)于成人用量）。3）紗布蒙蓋注射區(qū)每周1次，共治療3周。空白組：造模后同條件、同期飼養(yǎng)。

1.5KOA軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)靜脈空氣栓處死動(dòng)物。截取脛骨面軟骨組織，洗去血污雜質(zhì)，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗2次后，剪切至1 mm3大小的碎塊，移入超凈臺(tái)。加入2.5 g/L的胰蛋白酶5 mL，磁力棒搖蕩消化40 min，吹打棄上清，加入5 mL的0.025%Ⅱ型膠原酶，恒溫震蕩箱放置4～6 h。收集分離細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，將液溶解的細(xì)胞放入DMEM液中使細(xì)胞懸液均勻分布，反復(fù)吹打，將軟骨細(xì)胞接種在25 cm2的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中。逐日觀察，2～3 d換1次液，原代細(xì)胞長滿后傳代，取2代細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)用［4］。

1.6MTT測(cè)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖3組細(xì)胞接種在96孔板中，接種密度2×104個(gè)細(xì)胞/cm2，隔日換液。培養(yǎng)16 d后取出一塊96孔板進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL DMSO溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀570 nm波長測(cè)定吸光度值。

1.7蛋白免疫印跡法檢測(cè)將3組軟骨組織按照總蛋白提取試劑盒說明書要求提取總蛋白，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和光吸收酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。100℃水浴3 min，加入蛋白上樣緩沖液，充分混合并離心至管底，將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，設(shè)定管家基因β-actin為內(nèi)參。置入電泳槽，加轉(zhuǎn)膜緩沖液，電泳槽置冰盆中，350 mA，60 min轉(zhuǎn)膜，洗膜液（1 000 mL，PBS+1 mL，吐溫-20）漂洗3次，每次10 min。聚偏二氟乙烯膜（PVDF）置一抗中孵育，搖床上4℃，過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜液漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒中A液和B液按照1∶1混合搖勻，條帶在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影，通過灰度分析比較Sox9蛋白產(chǎn)物在3組軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況［5-6］。

1.8觀察指標(biāo)1）3組軟骨細(xì)胞的增殖情況。2）3組軟骨細(xì)胞Sox9基因的表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

3組細(xì)胞48 h后完全貼壁，對(duì)照組原代細(xì)胞貼壁較治療組晚，且對(duì)照組原代細(xì)胞繁殖速度較治療組慢，治療組原代細(xì)胞6 d后基本長滿瓶壁，多為單層生長，見圖1。

圖1　原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)6 d（×100）Fig.1　Primary articular cartilage cells 6 days after cultured（×100）

MMT對(duì)比3組軟骨細(xì)胞組的增殖變化，見表1。3組軟骨細(xì)胞吸光值對(duì)比，結(jié)果表明治療組與對(duì)照組軟骨細(xì)胞增殖的水平均高于空白組軟骨細(xì)胞（P＜0.05），治療組軟骨細(xì)胞增殖的水平高于對(duì)照組軟骨細(xì)胞（P＜0.05）。提示伸筋易骨矯形手法能提高軟骨的增值能力，更好的幫助損傷的軟骨組織修復(fù)。

表1　MMT比較3組軟骨細(xì)胞的增殖變化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

表1　MMT比較3組軟骨細(xì)胞的增殖變化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

注：與空白照相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，#P＜0.05。

組別治療組對(duì)照組空白組OD570值0.237±0.013#0.192±0.014* 0.072±0.012

蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組細(xì)胞均有Sox9蛋白表達(dá)。通過灰度分析后結(jié)果顯示，治療組軟骨細(xì)胞Sox9蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖2。

圖2　3組軟骨組織Sox9蛋白表達(dá)的免疫印跡檢測(cè)對(duì)比Fig.2　Expression of Sox9 protein compared of cartilages organize by Western blot among 3 groups

3　討論

關(guān)節(jié)畸形是KOA病程后期患者的主要癥狀，患者下肢力線偏移、關(guān)節(jié)活動(dòng)能力下降、關(guān)節(jié)周圍軟組織退變，最終導(dǎo)致全膝關(guān)節(jié)功能喪失，關(guān)節(jié)畸形是KOA致殘的主要病理因素［7-8］。目前對(duì)糾正KOA關(guān)節(jié)畸形的主要手段是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)和膝關(guān)節(jié)矯形支架，這兩種術(shù)式通過矯正下肢力線，調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)周圍軟組織的相應(yīng)關(guān)系達(dá)到正畸作用，但此類手術(shù)治療費(fèi)用昂貴、手術(shù)禁忌癥和并發(fā)癥較多［9-10］。推拿作為一種以體表軟組織為主要施術(shù)部位的保守治療手段，可以增強(qiáng)股四頭肌肌力［11］，調(diào)節(jié)股四頭肌和腘繩肌肌張力［12］，緩解關(guān)節(jié)疼痛及水腫，從而矯正下肢力線達(dá)到正畸療效［13］。

伸筋易骨矯形手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎已在臨床應(yīng)用了近十年，臨床研究顯示，伸筋易骨矯形手法可以明顯提升KOA患者膝關(guān)節(jié)周圍軟組織功能，改善軟骨組織的生長環(huán)境，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞合成代謝，從根本上防治KOA。本實(shí)驗(yàn)研究該手法防治KOA的作用機(jī)制，結(jié)果可顯示手法和針劑對(duì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞修復(fù)均有一定作用，筋易骨矯形手法能夠更好的上調(diào)Sox9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞合成代謝，加快組織修復(fù)。

Sox是一組與胚胎軟骨早期發(fā)育的相關(guān)基因家族，在軟骨的發(fā)育成熟過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的調(diào)控作用［14-15］，與軟骨形成分化關(guān)系較為密切的主要有3種Sox蛋白亞型，Sox9是促進(jìn)軟骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞生長因子和理化刺激通過各種信號(hào)通路，激活Sox9的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而激活下游Sox5、Sox6，Sox9與Sox5、Sox6等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)成軟骨分化特異性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而形成軟骨，因此Sox9被稱為成軟骨分化的“分子開關(guān)”［17］。其中Sox9是軟骨間質(zhì)細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞募集過程中重要的調(diào)控因子［17］，Sox9主要是在靜止層和增殖層軟骨細(xì)胞中表達(dá)，維持軟骨細(xì)胞表型并協(xié)同抑制細(xì)胞的終末分化，通過與基因表達(dá)調(diào)控的增強(qiáng)子元件相結(jié)合而增強(qiáng)Ⅱ型膠原基因表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成［18］。手法治療上調(diào)Sox9的表達(dá)，可能是修復(fù)軟骨組織、治療KOA的一個(gè)原因。

《醫(yī)宗金鑒》對(duì)推拿手法的總結(jié)有“摸、接、端、提、推、拿、按、摩”8法，伸筋易骨矯形手法對(duì)膝痹的“氣血郁滯，為腫為痛”，施以“按其經(jīng)絡(luò)，以通郁閉之氣，摩其壅聚，以散郁結(jié)之腫”。通過手法緩解膝周肌肉緊張度，松解髕周軟組織粘連，改善脛骨上段、股骨下段及髕骨周圍的血液循環(huán)，調(diào)整關(guān)節(jié)周圍軟組織張力，進(jìn)而改善軟骨細(xì)胞生長環(huán)境，修復(fù)受損軟骨組織。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，伸筋易骨矯形手法可提高軟骨細(xì)胞增殖速度，上調(diào)Sox9表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨組織合成代謝，從而改善KOA癥狀。

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（本文編輯：馬英，高杉）

《天津中醫(yī)藥》和《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》再次入選中國科技核心期刊

2015年10月21日，科技部中國科學(xué)技術(shù)信息研究所（ISTIC）在北京國際會(huì)議中心舉行中國科技論文統(tǒng)計(jì)結(jié)果新聞發(fā)布會(huì)暨《2015年版中國科技期刊引證報(bào)告（核心版）》發(fā)布會(huì)。天津中醫(yī)藥大學(xué)主辦的《天津中醫(yī)藥》和《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》兩刊均再次入選“中國科技核心期刊”（中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊）

據(jù)悉，《2015年版中國科技期刊引證報(bào)告（核心版）》中，《天津中醫(yī)藥》屬于中醫(yī)學(xué)類和中藥學(xué)類期刊，2014年核心影響因子0.691、排名第6，核心總被引頻次1528、綜合評(píng)價(jià)總分41.6、總排名第19?！短旖蛑嗅t(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》屬于中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)類期刊，2014年核心影響因子為0.856、排名第1，核心總被引頻次659、綜合評(píng)價(jià)總分47.3、總排名第6，取得了歷次期刊評(píng)價(jià)中的最好成績。

自1987年以來，中國科學(xué)技術(shù)信息研究所每年定期公布中國科技論文發(fā)表狀況和趨勢(shì)，并在此基礎(chǔ)上拓展到中國專利、科技期刊、學(xué)術(shù)圖書等領(lǐng)域產(chǎn)出情況的統(tǒng)計(jì)分析。2015年統(tǒng)計(jì)報(bào)告包括我國發(fā)表的國際論文數(shù)量、國際論文被引用情況、國內(nèi)發(fā)表論文數(shù)量、國內(nèi)論文被引用情況、我國各學(xué)科領(lǐng)域論文分布和影響、我國各地區(qū)論文分布和影響、我國各類型機(jī)構(gòu)論文分布和影響、我國國際合著論文情況、我國高影響科技論文情況、我國科技期刊有關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析以及我國出版社引證報(bào)告。

Effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on chondrocytes metabolism and the expression of Sox9 in rabbits

ZHAO Qiang，WANG Yi-zhou
（Department of Massage，Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Tianjin 300120，China）

［Objective］To study the effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on rabbit chondrocytes metabolism and the expression of Sox9.［Methods］KOA rabbits were randomly divided into 2 groups.The treatment group used Shenjin Yigu orthopaedic manipulation therapy，the control group using intra-articular injection of sodium hyaluronate，culturing chondrocytes in vitro after drawing materials.Microscope observation and comparing of chondrocytes’proliferation between two groups by MMT method，analyzing the expression of Sox9 of chondrocytes between two group by Western-blot method.［Results］Microscopic observation of the treatment group and control group of chondrocytes proliferation faster than those in the blank group and the multiplicaion rate of the treatment group was fastest than those in the control and blank groups，and better proliferation of chondrocytes in the treatment group than that in the control group detected by MMT method（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of Sox9 was higher in the treatment group than that in the control group（P＜0.05）.［Conclusion］Shenjin Yigu orthopaedic manipulation can improve the speed of proliferation of chondrocytes，enhancing chondrocytes’multiplication ability.Simultaneously this manipulation can increase the expression level of Sox9 in injured cartilage tissue，to promote the synthesis of chondrocyte metabolism ability.

Shenjin Yigu orthopaedic manipulation；knee joint；chondrocyte metabolism；Sox9

R684

A

1672-1519（2016）02-0096-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81473795）。

趙強(qiáng)（1968-），男，主任醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)病的臨床和基礎(chǔ)研究。

（2015-10-08）