苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的作用研究

陳　偉　田　魯　李　易　王　港　高　珊

苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的作用研究

陳偉田魯李易王港高珊

目的 評價苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠的療效。方法 雄性SD大鼠隨機分為正常組、2型糖尿病腎病組（模型組）以及苦瓜總皂苷組（治療組），每組16只，比較治療4周后、8周后HIF-1α和VEGF表達(dá)特點。結(jié)果 與模型組相比，治療組尿蛋白和血清肌酐明顯減少，血糖明顯升高（P<0.05）；HE染色可見苦瓜總皂苷對糖尿病腎病帶來的腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生有一定改善；RT-PCR和Western Blot可見：與模型組相比，治療組大鼠腎臟組織HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 苦瓜總皂苷可抑制HIF-1α及VEGF的表達(dá)，改善糖尿病大鼠腎功能及腎臟損害，進而延緩2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

苦瓜總皂苷； 缺氧誘導(dǎo)因子-1α； 血管內(nèi)皮生長因子； 2型糖尿??； 腎功能

隨著人們生活水平的提高，糖尿病特別是2型糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的一大疾病，其與腫瘤、心血管疾病并稱為威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病［1］。糖尿病患者的危害不光是血糖的升高，由血糖升高帶來的心腦血管病、腎病等也嚴(yán)重危害著人們的健康，有研究顯示在所有需要血透治療的疾病中糖尿病腎病處于第二位，糖尿病腎病已經(jīng)成為威脅糖尿病患者的一大疾?。?］。關(guān)于糖尿病腎病的發(fā)生機制研究較多，目前認(rèn)為血脂失調(diào)、血壓異常、氧化應(yīng)激以及血糖毒害等均參與了本病的進展，而上述的幾條毒害都與腎組織缺氧密不可分［3］。腎臟組織缺氧可以直接誘導(dǎo)腎臟組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)升高，HIF-1α表達(dá)的升高可以激活血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，最終造成一系列腎臟病理反應(yīng)［4］。本研究以高糖高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，分析格列齊特治療后，其腎臟組織中HIF-1α、VEGF表達(dá)特點，以期為苦瓜總皂苷的藥物開發(fā)和本病的治療提供一定參考。

1　材料與方法

1.1動物和試劑盒及儀器

清潔級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，購自華中科技大學(xué)動物實驗中心，合格證號：SCXK（鄂）2010-0009，均在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后行相應(yīng)實驗。

血糖、血肌酐和血白蛋白試劑盒（南京建成生物工程研究所）、總RNA提取試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）、瓊脂糖（上海仁凱生物科技有限公司）、引物（上海生工生物股份有限公司），多克隆抗體HIF-1α、單克隆抗體β-actin以及及ECL發(fā)光試劑盒（美國 Santa Cruz公司）、單克隆抗體VEGF（Abcam公司）、二抗（金斯瑞生物科技有限公司）。

TDZ5-WS型低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器公司）、UV1100型紫外分光光度儀（Techcomp公司）、7900HTPCR儀（ABI公司）、中晶2500型掃描儀（上海中晶科技有限公司）、Mini-Protean Tetra蛋白電泳儀（美國Bio-rad公司）。

1.2動物分組及造模方法

大鼠隨機分成正常對照組、2型糖尿病腎病模型組（模型組）以及苦瓜總皂苷干預(yù)組（治療組），每組16只，其中糖尿病腎病組和模型組施行單側(cè)腎切除手術(shù)，手術(shù)具體操作方法為：（1）1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，固定；（2）切開大腹部找到左腎；（3）將左腎蒂部位結(jié)扎并摘除，之后給青霉素注射、縫合；（4）正常組大鼠采用同樣方法處理，但腎臟不摘除；（5）手術(shù)后每天給予大鼠肌注青霉素1周。

將大鼠再飼養(yǎng)3周后，糖尿病腎病組以及模型組給予鏈脲佐菌素60 mg/kg一次性腹腔注射，注射3天后尾靜脈取血，血糖儀測定，空腹血糖＞16.7 mmol/L時判定造模成功。

模型建立成功后，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃，于實驗2、4、6、8周末分別測大鼠血糖水平；實驗第4周、8周處死大鼠各半，測24小時尿蛋白定量；腎組織HE染色、RT-PCR以及Western Blot檢測腎組織HIF-1α和VEGF表達(dá)。

1.3標(biāo)本收集

1.3.1尿液標(biāo)本收集 大鼠置于代謝籠收集24小時尿液并計算總尿量。24小時尿蛋白量采用公式為：24h尿蛋白量（mg）=尿蛋白濃度（g/L）×24h尿量（mL）。

1.3.2血液和腎臟收集 第2周和第6周采用斷尾法收集大鼠血液，分別于第4周、第8周后禁食12小時后，10%水合氯醛（2.0 mL/kg）麻醉，麻醉完成后沿大鼠腹中線切開暴露心臟，拿注射器心尖取血，取血后摘除右腎。全自動生化分析儀測定血清白蛋白及血清肌酐值。

1.4HE染色

腎臟取出后，統(tǒng)一切腎尖端處四分之一置于4%的中性多聚甲醛溶液中保存，之后交由黃石市中心醫(yī)院病理科完成，得到切片后，光鏡觀察照相。

1.5半定量PCR

從超低溫冰箱中取出腎臟組織用手術(shù)刀小心稱取30 mg，碾磨棒將組織碾磨勻漿，然后提取總RNA并定量，定量后調(diào)平，之后參照文獻［5］進行PCR擴增mRNA和凝膠電泳，引物序列如下。

HIF-1α引物設(shè)計為：Primer A：5′AATGGGATCGTGAAACGCCG3′，Primer B：5′AGGGGAGCATGTTCCTGATG3′；

VEGF引物設(shè)計為：Primer A：5′AGTCACCATGGGAAGAGACT3′，Primer B：5′CTGTTCCGTCGACCACCATT3′；

β-actin引物設(shè)計為：Primer A：5′GTGACGGAGCGCCAAGCAAGAG-3′，Primer B：5′ACGCACTGTAACTTGGGAAGTGTGG-3′。

1.6Western Blot檢測

取腎臟組織小心稱取100 mg電子勻漿機磨碎，勻漿后低溫高速離心機離心（4000 rpm），離心后每組各取樣本80 μg進行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳方法按照文獻進行［5］。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD，方差不齊則采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　大鼠腎臟切片HE染色

2　結(jié)果

2.1實驗大鼠一般情況

從造模成功后開始記錄大鼠一般情況，發(fā)現(xiàn)正常組大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)以及平?；顒泳＃瑫r毛發(fā)光滑，呈明顯的白色；模型組大鼠均呈現(xiàn)出明顯的多尿、多飲、多食等癥狀，其精神明顯不佳，此外毛發(fā)可見其明顯雜亂，同時表現(xiàn)有淡黃色（可能沾有尿液）；治療組大鼠則不同，治療組大鼠在治療4周后相較于正常組飲食也呈增加的趨勢，但沒有模型組增加量大，治療8周后與治療4周后情況基本一致。

2.2血糖、24小時尿蛋白定量以及血肌酐和血白蛋白的比較

治療開始后，每2周測定一次大鼠血糖，由表1可以看出，相較于模型組，苦瓜總皂苷可以明顯降低2型糖尿病腎病大鼠血糖，同時其血糖隨著治療時間的增加，有逐漸降低的趨勢；由表2可以看出，經(jīng)苦瓜總皂苷治療后，治療組24小時尿蛋白量以及血漿肌酐較模型組明顯下降（P<0.05），血漿白蛋白明顯升高（P<0.05）。詳見表1、表2。

表1　治療全程中大鼠血糖變化（mmol/L，x±s，n=16）

表2　治療后大鼠24小時蛋白尿量、以及血肌酐和血白蛋白變化水平變化（x±s，n=16）

2.3HE染色

正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，同時其腎小球以及腎小管形狀也較為致密和規(guī)則，模型組大鼠腎小管較大，腎小球受到了一定的擠壓，為輕微的炎癥反應(yīng)，治療4周后，大鼠腎小管逐步縮小，細(xì)胞也趨于致密，治療8周后，大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小球、腎小管形狀較為規(guī)則，但仍有一定的炎癥反應(yīng)。詳見圖1。

2.4大鼠HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)

與模型組相比，治療4周后大鼠肝臟HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)有一定的降低，但改善不明顯，治療8周后則明顯低于模型組（P<0.05）。詳見圖2和表3。

2.5大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)

與模型組相比，治療4周后大鼠肝臟HIF-1α和VEGF蛋白有一定的降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，治療8周后則明顯低于模型組（P<0.05）。詳見圖3和表4。

圖2　各組大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)

表3　治療4周和治療8周后，大鼠HIF-1α和VEGF mRNA相對表達(dá)（n=16，x±s）

圖3　各組大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的表達(dá)

表4　治療4周和治療8周后，大鼠HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)（n=16，x±s）

3　討論

糖尿病是世界三大威脅人類健康的疾病之一，特別是2型糖尿病在整個世界范圍內(nèi)均呈高發(fā)的態(tài)勢。以美國為例，全美約有7%的人患有2型糖尿病，同時每年遞增200萬。中國有糖尿病患者超過9000萬，從患病人數(shù)上來說，已經(jīng)成為糖尿病第一大國，其危害不言而喻［5］。2型糖尿病的危害在于其糖脂代謝異常帶來的并發(fā)癥，其中糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，本病發(fā)生后，患者有異常尿蛋白排泄，同時隨著病程的進展，可累及腎小管、腎小球以及腎間質(zhì)，進而可以引起患者腎功能逐漸減退，腎功能的減退可造成患者排泄發(fā)生障礙，這給患者的生活和經(jīng)濟、心理等帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［6］。目前臨床對本病的治療沒有特效藥，治療手段仍然以血糖控制和飲食控制為主，因此開發(fā)一種新型的藥物治療本病或者延緩本病的進展具有十分重要的意義。

關(guān)于2型糖尿病腎病發(fā)病機制的研究目前有許多的學(xué)說［7-9］，其中研究較多的有基因氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳學(xué)說、缺氧學(xué)說、炎癥學(xué)說、代謝障礙學(xué)說、血流動力學(xué)改變學(xué)說等，其中缺氧學(xué)說已經(jīng)得到研究證實，由于引起缺氧的原因眾多，因此阻斷由于缺氧造成的損害已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點［9］。腎臟缺氧危害之一是造成HIF-1α表達(dá)的異常增高，而HIF-1α又是體內(nèi)重要的缺氧誘導(dǎo)因子，其幾乎參與了哺乳動物所有的器官中的缺氧應(yīng)答［10-11］。當(dāng)腎臟組織發(fā)生缺血/缺氧表現(xiàn)時，會大量分泌HIF-1α，加強細(xì)胞糖酵解反應(yīng)，以彌補缺氧引起的細(xì)胞供能不足［12］；此外HIF-1α分泌的增加，也會促進腎臟組織中新生血管生成，以加強紅細(xì)胞攜氧的能力，從而改善細(xì)胞的物質(zhì)代謝，而這其中刺激VEGF分泌和合成起著關(guān)鍵的作用，HIF-1α可刺激VEGF的分泌，進而誘導(dǎo)新生血管形成，而分泌的VEGF又可以增加血管的通透性，進而改變腎小球濾過膜的通透性，最終導(dǎo)致患者發(fā)生蛋白尿［13-14］。

苦瓜其本身屬于葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜Momordica charantia L.的未成熟果實的一種，但對于其藥用機理人們了解甚少?？喙嫌兄凭玫娜胨幨?，近年來許多學(xué)者對苦瓜進行了研究，研究均提示苦瓜具有明顯的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低膽固醇，甚至可以抗艾滋病病毒的作用［15-16］。本研究用苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠，結(jié)果顯示：正常組大鼠腎組織切片層次分明，無炎癥反應(yīng)，模型組有明顯的炎癥反應(yīng)，治療4周后腎組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善，治療8周后進一步改善，但仍然有一定的炎癥反應(yīng)，這提示苦瓜總皂苷雖然不能治療2型糖尿病腎病，但可以延緩其發(fā)病進展；苦瓜總皂苷不僅有降低血糖的作用，同時也可以明顯地改善2型糖尿病大鼠24小時尿量、尿蛋白以及血清肌酐，抑制大鼠腎臟HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)，具有很好的藥用價值。

綜上所述，苦瓜總皂苷可通過抑制HIF-1α及ET-1的表達(dá)，改善糖尿病大鼠腎臟損害，延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

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（本文編輯：董歷華）

Effects of Momordica total saponins to HIF-1α and VEGF expression in kidney tissue of type 2diabetic nephropathy rats

C HEN Wei，TIAN Lu，LI Yi，et al. Department of Nephrology，Huangshi Central Hospital of Hubei Province，Huangshi 435000，China

GAO Shan，E-mail：hsyiyuantougao@163.com

Objective To investigate the efficacy in type 2 diabetic nephropathy rats after treated with Mcomordica total saponins.Methods Male SD rats were randomly divided into control group，diabetic nephropathy model group and Momordica total saponins treatment group.After treatment for 4 and 8 weeks，HIF-1α and VEGF expressions were detected respectively.Results Compared with the model group，there were significantly decreased in urine protein and serum creatinine，and increased in blood glucose in the treatment group（P<0.05）.The pathological tissue after HE staining showed that Momordica total saponins could relieve incrassation of glomerular basement membrane，and mesangial cell proliferation.RT-PCR and Wester Blot results showed that HIF-1α and VEGF level in the treatment group were significantly lower than that in the model group（P<0.05）.Conclusion Momordica total saponins could inhibit the expression of HIF-1 and VEGF，improve renal function，mitigate renal damage in diabetic rats，and delay the development of diabetic nephropathy.

Momordica total saponins； Hypoxia inducible factor-1； Vascular endothelial growth factor； Type 2 diabetes mellitus； Renal function

R692.39

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.004

湖北省自然科學(xué)基金（2012FFA016）

435000 湖北省黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科（陳偉、田魯、李易、王港）；黃石市第二醫(yī)院腎內(nèi)科（高珊）

陳偉（1981-），碩士，主治醫(yī)師。研究方向：慢性腎臟病。E-mail：506727553@qq.com

高珊（1979-），女，本科，講師，主治醫(yī)師。研究方向：腎病和腎臟透析等綜合治療。E-mail：hsyiyuantougao@163.com

2015-10-15）