抑癌基因死亡相關(guān)蛋白激酶在腫瘤中的研究進(jìn)展

2016-09-10 09:14:20姜應(yīng)傳

現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué) 2016年6期

姜應(yīng)傳，陳炳

·講座與綜述·

姜應(yīng)傳，陳炳

1995年，以色列學(xué)者Deiss及其同事首次發(fā)現(xiàn)死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）[1]，其編碼的蛋白是相對(duì)分子質(zhì)量為16×104的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[2]，是細(xì)胞凋亡的一種正調(diào)控因子[3]。DAPK及其相關(guān)的信號(hào)通路在很多疾病中發(fā)揮了重要的作用，比如動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥以及腫瘤。它可以通過(guò)激活死亡受體、活化細(xì)胞活素類、基質(zhì)脫附、神經(jīng)酰胺化等各種方式調(diào)節(jié)或執(zhí)行細(xì)胞死亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，DAPK是一種抑癌基因，因此它及其相關(guān)信號(hào)通道的研究對(duì)于腫瘤的早期診斷及基因靶向治療有著重要的意義。

1 DAPK的結(jié)構(gòu)

人類DAPK基因全長(zhǎng)為4293 bp，位于第9號(hào)染色體的q34.1區(qū)域。DAPK編碼的蛋白是一種復(fù)合中心結(jié)構(gòu)的蛋白，由接觸反應(yīng)中心和非接觸反應(yīng)中心構(gòu)成。接觸反應(yīng)中心是由核心的激酶區(qū)和鈣離子/鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)組成，其中后者是最重要的組成部分。鈣調(diào)蛋白的結(jié)合引起的結(jié)構(gòu)變化可以使 DAPK通過(guò)結(jié)合底物而激活，而絲氨酸308(Ser308)殘基的磷酸化可以通過(guò)降低其對(duì)鈣調(diào)素的親和力抑制DAPK的功能。非接觸反應(yīng)中心則是由1個(gè)細(xì)胞骨架結(jié)合區(qū)、1個(gè)死亡區(qū)、2個(gè)P-loop環(huán)、8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列區(qū)和富含絲氨酸的尾部組成[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DAPK家族有5個(gè)成員，它們的核心激酶區(qū)及肌球蛋白輕鏈激酶卻基本相似，但位于C端的死亡區(qū)各不相同，被認(rèn)為與 DAPK的功能有關(guān)。DAPK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的精確機(jī)制尚不明確。研究表明，C端的死亡區(qū)通過(guò)參加Fas L及腫瘤壞死因子-(TNF-)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)介導(dǎo)DAPK的功能。該區(qū)如果被敲除，則會(huì)下降DAPK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，因此C-端死亡區(qū)是其誘導(dǎo)凋亡所必需的[5]。死亡區(qū)后是長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸殘基的尾部，可抑制DAPK誘導(dǎo)凋亡的功能[6]。

2 DAPK的調(diào)控機(jī)制

DAPK在細(xì)胞水平擁有多種調(diào)控機(jī)制。多項(xiàng)研究表明，在轉(zhuǎn)錄水平DAPK基因啟動(dòng)子甲基化與其表達(dá)的蛋白缺失強(qiáng)烈相關(guān)[7]。DAPK啟動(dòng)子擁有一個(gè)密集的CpG島，很多轉(zhuǎn)錄因子例如NF B，E2F1和AP1也定位于這些區(qū)域的序列。在直腸癌中，有5%～80%的CpG島發(fā)生甲基化，但是至今為止，卻沒(méi)有系統(tǒng)的研究去比較各個(gè)不同的CpG島對(duì)蛋白表達(dá)的意義。

DAPK的轉(zhuǎn)錄可被促炎癥轉(zhuǎn)錄因子STAT3和Nf B抑制[8]。此外，DAPK 的mRNA表達(dá)能夠被p53，C/EBP-，HSF1和SMAD等觸發(fā)[9]。其中C/EBP-的結(jié)合取決于IFN的暴露，而SMAD結(jié)合到相應(yīng)的序列則需要TGF-的觸發(fā)。一般而言，DNA損害都會(huì)都可能會(huì)引起DAPK的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)性上調(diào)[10]。最近研究證明，有些miRNA（miR-103，miR-107）結(jié)合于DAPK基因3'端的不翻譯區(qū)。miR-103 和miR-107的高表達(dá)與直腸癌的患者的高轉(zhuǎn)移率及低生存率相關(guān)，也與DNPK作為轉(zhuǎn)移抑制因子的角色相呼應(yīng)[11]。通過(guò)電子數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算機(jī)模擬提示有些miRNA也可能在DAPK的調(diào)控中發(fā)揮作用[10]。盡管如此，在這方面的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還是有所欠缺。

DAPK在翻譯后的穩(wěn)定性由兩套不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶解系統(tǒng)調(diào)控:（1）泛素-蛋白酶體體系，其中熱休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白（CHIP）參與介導(dǎo)DAPK和HSP90復(fù)合物的形成。其中，HSP90主要起穩(wěn)定DAPK水平的作用；而DAPK的錨蛋白重復(fù)區(qū)與DIP1/ MIB1相結(jié)合，可以調(diào)節(jié)DAPK的多泛素化以及在蛋白酶體的降解[6]。（2）自吞噬細(xì)胞/溶酶體體系。由TSC1and TSC2組成的TSC復(fù)合體（mTOR）抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1的活性。DAPK的死亡區(qū)和TSC2的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致2個(gè)結(jié)果[12]：T SC2基因的磷酸化，TSC復(fù)合物的解離和mTOR的活化；TSC2通過(guò)一個(gè)翻譯后的調(diào)控機(jī)制直接降低DAPK的水平。

3 DAPK與腫瘤

和其他抑癌基因一樣，DAPK的功能在多種腫瘤中被抑制。但與傳統(tǒng)抑癌基因P53等不同，DAPK在腫瘤中通常是表現(xiàn)為表達(dá)缺失而不是突變[2]。DAPK的表達(dá)缺失主要源于5'端不翻譯區(qū)發(fā)生甲基化，雖然不太頻繁，但它仍然是一個(gè)純合子缺失的結(jié)果。超過(guò)30種腫瘤被發(fā)現(xiàn)發(fā)生DAPK基因甲基化，而它們的甲基化率卻不盡相同。盡管如此，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞性肺癌的細(xì)胞系存在DAPK蛋白的表達(dá)和基因超甲基化同時(shí)存在的現(xiàn)象[13]。腎癌及慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤中也有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象的出現(xiàn)。這說(shuō)明在某些腫瘤中存在某種重要的DAPK翻譯后的調(diào)控機(jī)制在調(diào)節(jié) DAPK蛋白的表達(dá)。由此可見(jiàn)，DAPK基因的甲基化并不意味著DAPK蛋白表達(dá)的缺失。

盡管大量的文獻(xiàn)支持DAPK是一種抑癌基因，但有些研究卻得出相反結(jié)論。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種小鼠的 DAPK的剪接變異體（DAPK-）能夠促進(jìn)細(xì)胞生存[14]。而在人類中，至今僅發(fā)現(xiàn)一種DAPK剪接變異體（s-DAPK-1）能夠介導(dǎo)全長(zhǎng)DAPK蛋白的降解，而它在腫瘤中的作用還不清楚。但是考慮到其他抑癌基因如P53和P73在腫瘤中的積極作用，很可能在腫瘤中存在更多的 DAPK剪接變異體能夠中和野生型DAPK的作用從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn) DAPK能夠在生長(zhǎng)因子的作用下反應(yīng)性地激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。Tanaka等[16]發(fā)現(xiàn)DAPK是數(shù)種子宮癌細(xì)胞存活所必須的，而敲除DAPK基因能夠增強(qiáng)5-氟尿嘧啶（5-FU）誘導(dǎo)人類子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡[17]。所有的這些研究表明，在某些組織和基因環(huán)境中，DAPK能夠產(chǎn)生促細(xì)胞生存的作用和促進(jìn)腫瘤發(fā)生過(guò)程。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-b）可以反應(yīng)性地刺激DAPK的表達(dá)和凋亡活性增加。DAPK的表達(dá)又可以激活P53的活性，造成DNA的破壞。其他的死亡信號(hào)通道，如轉(zhuǎn)化癌基因E2F1和Myc也能夠誘導(dǎo)DAPK表達(dá)。除了P53、ERK1和ERK2也參與DAPK誘導(dǎo)的凋亡。DAPK能夠阻斷ERK向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，使其保留在細(xì)胞質(zhì)中，從而阻斷ERK生存信號(hào)通路。ERK-DAPK軸構(gòu)成一個(gè)正反饋回路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除此之外，DAPK在細(xì)胞生存方面也扮演重要角色，體現(xiàn)在其激活生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及抵抗腫瘤壞死因子（TNF）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，一旦DAPK出現(xiàn)表達(dá)缺失，正常的細(xì)胞凋亡失去調(diào)控，不斷增殖，最終可能形成腫瘤。

4 DAPK與腫瘤轉(zhuǎn)移

Inbal等[18]最早發(fā)現(xiàn)DAPK和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系，他們?cè)谝粋€(gè)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞系的Lewis肺癌細(xì)胞克隆中，高轉(zhuǎn)移性的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)了DAPK的表達(dá)缺失；體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DAPK表達(dá)能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)某些凋亡刺激因子的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)提示DAPK表達(dá)的缺失能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供生存優(yōu)勢(shì)來(lái)克服轉(zhuǎn)移進(jìn)程各個(gè)階段遭遇的阻礙，比如細(xì)胞基質(zhì)粘附的缺失、暴露于死亡刺激因子、對(duì)內(nèi)應(yīng)力的應(yīng)答以及面對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的不同微環(huán)境。在另外一個(gè)結(jié)腸癌裸鼠的動(dòng)物模型中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)DAPK在侵襲/轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟中均發(fā)揮作用[19]。

基于研究腫瘤患者的臨床樣本，同樣觀察到DAPK和腫瘤轉(zhuǎn)移的聯(lián)系。在多種腫瘤中普遍觀察到DAPK的下調(diào)，有時(shí)候還和腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程相關(guān)。比如，DAPK在肺癌中表達(dá)的下調(diào)和腫瘤分期及淋巴結(jié)侵犯相關(guān)[20]。在胃癌中，DAPK啟動(dòng)子的超甲基化和腫瘤分期、淋巴結(jié)侵犯情況密切相關(guān)[21]。在垂體瘤、泌尿道腫瘤和肝癌中發(fā)現(xiàn)DAPK表達(dá)的缺失和腫瘤分期及侵襲性相關(guān)。

在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)常會(huì)遇到促氧化環(huán)境，這些都能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的多方面進(jìn)程，比如增加細(xì)胞活力、侵襲性和血管生成等。DAPK作為一種關(guān)鍵因子，能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激應(yīng)激細(xì)胞死亡的敏感性。此外，DAPK還能阻斷踝蛋白（talin）與整合素b1的結(jié)合，從而抑制整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，抑制細(xì)胞的移動(dòng)，抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[22]。不僅如此，DAPK還能調(diào)節(jié)數(shù)種細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白，例如肌球蛋白輕鏈II（MLCII），從而平衡細(xì)胞的收縮力和黏附力。

5 DAPK與腫瘤治療

靶向治療是如今腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。治療的靶點(diǎn)應(yīng)該符合以下幾個(gè)條件：（1）這個(gè)靶點(diǎn)在不同的疾病中表現(xiàn)的狀態(tài)不同，如基因的突變、表達(dá)的水平、翻譯后修飾及細(xì)胞定位等。（2）這個(gè)靶點(diǎn)在疾病中發(fā)揮重要的作用，包括維持或推進(jìn)疾病進(jìn)展甚至是對(duì)常規(guī)的治療起到拮抗作用。對(duì)這個(gè)靶點(diǎn)的介入能夠?yàn)榛颊邘?lái)有效的收益。（3）這個(gè)靶點(diǎn)是能夠藥物控制的。某些基因在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)完美卻在實(shí)際操作時(shí)困難重重，如RAS癌基因[23]。一個(gè)好的治療靶點(diǎn)其表達(dá)和活性要能夠特異性地對(duì)外部刺激做出反應(yīng)。

多項(xiàng)對(duì)于 DAPK催化區(qū)晶體結(jié)構(gòu)的研究都指向設(shè)計(jì)出特異錨定DAPK蛋白的小分子的可能性[24]。目前有兩種策略激活DAPK：（1）上調(diào)DAPK蛋白的表達(dá)；（2）對(duì)Ser308的自體磷酸化去磷酸化，激活DAPK激酶。目前共有9種試劑能夠通過(guò)提高mRNA的表達(dá)和抑制降解來(lái)提高DAPK蛋白的表達(dá)，有2種試劑能夠通過(guò)對(duì) Ser308的去磷酸化來(lái)提高DAPK的活性，還有3種試劑則兩者都能做到。但是沒(méi)有一種試劑能夠提高DAPK基因的表達(dá)。目前也無(wú)臨床藥物能夠真正特異地激活DAPK。盡管如此，假如一個(gè)藥物如甲基化抑制劑對(duì)患者的毒性不大且它的治療效果與激活DAPK相關(guān)，它就可以作為一種有效的DAPK激活劑用于臨床。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)去研究這類藥物和DAPK所產(chǎn)生的臨床效用。

6 展望

DAPK通過(guò)各種途徑影響細(xì)胞凋亡，在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移時(shí)亦發(fā)揮抑制作用。目前對(duì)于DAPK的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制以及DAPK在腫瘤中發(fā)揮的作用均有了比較深入的研究，但對(duì)于利用DAPK作為靶點(diǎn)治療腫瘤卻還沒(méi)有重大的突破。在今后不斷的研究中，或許能夠找到更多的線索。

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（本文編輯：鐘美春）