布仁其其格,高雅罕,包艷青,任秀娟,魏睿元,薩如拉,趙一萍,芒　來,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古馬遺傳資源保護及馬產(chǎn)業(yè)工程實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

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酸馬奶發(fā)酵過程中理化指標與細菌相的動態(tài)變化

布仁其其格1,2,高雅罕1,+,包艷青1,任秀娟1,魏睿元1,薩如拉1,趙一萍1,芒來1,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古馬遺傳資源保護及馬產(chǎn)業(yè)工程實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

分析了酸馬奶發(fā)酵過程中(0～96 h)部分理化指標以及細菌群落的變化情況。結(jié)果顯示酸馬奶發(fā)酵96 h內(nèi)pH為下降趨勢,發(fā)酵初期迅速酸化,發(fā)酵后期下降速度緩慢趨于穩(wěn)定,最低達到pH3.54;總蛋白質(zhì)、脂肪含量存在一定的起伏變化,72 h達到最高值;乳糖含量減少,而乳酸含量增加;葡萄糖、半乳糖、乙酸、丙酸含量在發(fā)酵過程中處于較低的水平;細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示酸馬奶發(fā)酵過程中存在豐富的細菌多樣性,并且群落結(jié)構(gòu)有明顯的演替變化。乳桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢細菌屬,在酸馬奶發(fā)酵過程中12～24 h呈現(xiàn)出上升的趨勢,而24～48 h時其含量下降。研究結(jié)果表明不同發(fā)酵時間酸馬奶營養(yǎng)價值存有差異。

酸馬奶,發(fā)酵過程,理化指標,細菌群落結(jié)構(gòu)

馬乳具有很高的營養(yǎng)價值,有研究表明可作為嬰幼兒代乳品[1],還具有提高免疫力[2]、抗疲勞等功效[3]。馬乳經(jīng)微生物發(fā)酵成為酸馬奶后其成分變得更加豐富易吸收,不僅營養(yǎng)保健價值得到了進一步提升,還延長了馬乳保存期。

酸馬奶主要依靠細菌和酵母菌發(fā)酵而成。殷文正[4]通過培養(yǎng)基法統(tǒng)計得知酸馬奶發(fā)酵72 h時乳酸菌可達8×109CFU/mL,酵母菌可達1×108CFU/mL。乳酸菌數(shù)比酵母菌數(shù)高一個數(shù)量級,對品質(zhì)形成具有重要作用。已有研究報道了新疆地區(qū)[5]、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟[6]以及蒙古國[7]等不同地區(qū)酸馬奶中乳酸菌情況。酸馬奶中乳酸菌研究手段從基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定[8-10]發(fā)展到以分子生物學(xué)方法分類鑒定[11-12],大大豐富了對其群落結(jié)構(gòu)了解。然而以往對酸馬奶中細菌及理化指標的關(guān)注只局限于發(fā)酵過程中某個時間點的樣品檢測,需要開展對酸馬奶發(fā)酵過程中細菌以及理化指標的動態(tài)變化研究。

傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶主要以牧戶為單位釀制,還沒有釀制的統(tǒng)一標準。為了使研究結(jié)果更加可靠,選取具有18年釀制酸馬奶經(jīng)驗,酸馬奶品質(zhì)口感評價較高的牧戶,完全參照牧戶家做法釀制酸馬奶采集樣品。采用焦磷酸測序技術(shù)以及多種檢測分析手段研究不同發(fā)酵時間點酸馬奶中細菌群落結(jié)構(gòu)和部分理化指標,從而對酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中細菌及成分變化規(guī)律進行初探。

1　材料及方法

1.1材料與儀器

在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正鑲黃旗一牧戶家,參照牧戶家做法釀制酸馬奶進行樣品收集。一個體系共3.5 L,其中鮮馬奶與發(fā)酵劑以13∶1混勻,共有三個平行發(fā)酵,發(fā)酵劑采用牧民家中酸馬奶。每隔2.5 h搗拌300次,一天共進行5次。發(fā)酵溫度在(22±2)℃,每隔12 h采集一次樣品收集至96 h,液氮保存帶回實驗室做后續(xù)實驗。

乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳糖、葡萄糖和半乳糖標準品美國Sigma;超純水;甲醇：色譜純、磷酸-磷酸鹽緩沖液：0.010 mol/L pH=2.0自配、鹽酸優(yōu)級純，天津市福晨化學(xué)試劑廠;E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒OMEGA公司。

450-GC氣相色譜儀德國布魯克公司;Agilent1100液相色譜儀美國Agilent公司、PB-10酸度計德國賽多利斯公司;Roche GS FLX基因組測序儀瑞士羅氏公司。

1.2實驗方法

1.2.1pH測定采樣現(xiàn)場以酸度計測定酸度值。

1.2.2總蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測定[13](GB5009.5-2010)。

1.2.3脂肪采用Rose-Gonile(哥特里-羅茲法)法測定[14]。

1.2.4乳酸、乙酸、丙酸和丁酸測定稱取室溫融化后搖勻的酸馬奶樣品1.0 g,與3 mL的HCl(1 mol/L)震蕩混勻,以12000 r/min的速度離心15 min,吸取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進Agilent1100液相色譜系統(tǒng)(Zorbax SB-Aq,5 μm,4.6 mm×150 mm,Agilent,USA)分析。流動相為0.010 mol/L磷酸—磷酸二氫鈉(pH=2.5),流速0.5 mL/min,紫外檢測波長210 nm,柱溫30 ℃,進樣量為20 μL。

1.2.5乳糖、葡萄糖和半乳糖測定參考文獻[15]的方法,稱取室溫融化后搖勻的酸馬奶樣品0.4 g,與1.2 mL超純水混勻,超聲波處理3 min后,以105 ℃高壓處理15 min,再在4 ℃下以4500 r/min速度離心10 min。吸取上清液0.45 μm膜過濾,進Agilent1100液相色譜系統(tǒng)(CARBOSeq CHO-620 CA 2.5 μm,4.6 mm×250 mm,Agilent,USA)分析。流動相為水,流速0.6 mL/min,柱溫90 ℃,進樣量為5 μL。

1.2.6細菌鑒定方法采用E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒,按說明提取酸馬奶宏基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組 DNA。PCR擴增16S rRNA 基因序列V1-V3區(qū),使用Roche GS FLX 基因組測序儀測序,由上海美吉生物公司完成測序工作。使用QIIME(v1.4.0)分析平臺開展序列的生物信息學(xué)分析[16-17],用RDP(Ribosomal Database Project)classifier[18]對序列進行同源性比對和種屬分類學(xué)鑒定。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPASS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,p值檢驗數(shù)據(jù)間差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1酸馬奶發(fā)酵過程中理化指標變化情況

2.1.1粗蛋白質(zhì)與脂肪鮮馬奶粗蛋白質(zhì)平均含量2.09%,如圖1所示,開始發(fā)酵24 h內(nèi)無明顯增長,24 h以后蛋白質(zhì)含量逐漸增多,到72 h達到最高值2.92%,之后含量開始減少,96 h時含量為2.57%,但是各時間點蛋白質(zhì)含量變化差異不顯著(p>0.05)。蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中被蛋白酶水解形成肽、氨基酸等小分子,部分作為能量物質(zhì)繼續(xù)代謝成為酸馬奶的風味物質(zhì)。同時酸馬奶發(fā)酵過程中新增蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì),例如具有抑菌殺菌作用的細菌素[19]等。數(shù)據(jù)表明在酸馬奶發(fā)酵72 h內(nèi)微生物的主要能源物質(zhì)并非是蛋白質(zhì),分泌含氮物質(zhì)增加大于消化利用速度。72 h之后蛋白質(zhì)含量降低表明,在該發(fā)酵階段,蛋白質(zhì)作為氮源消耗加大。

鮮奶與發(fā)酵過程中不同時間點酸馬奶的脂肪含量存在顯著差異(p<0.05)。脂肪含量在發(fā)酵至48 h時無明顯變化。隨后緩慢增加,72 h時達到最高值1.38%,到96 h時酸馬奶脂肪下降至1.33%,發(fā)酵過程中脂肪含量起伏變化差異不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明發(fā)酵過程中脂肪降解有限,而后期已形成的脂肪酸可能與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)[20],使脂肪酸含量下降。在酸馬奶發(fā)酵過程中所測得脂肪含量整體低于新疆地區(qū)酸馬奶[21]脂肪含量,存在地區(qū)差異。

圖1　酸馬奶發(fā)酵過程中脂肪、蛋白質(zhì)變化趨勢Fig.1　The trend of fat and protein in the fermentation process of Koumiss 注:XN代表鮮奶，圖2～圖5同。

2.1.2乳糖、葡萄糖、半乳糖在鮮馬奶中乳糖含量為20.83 g/L,隨著發(fā)酵含量減少。從圖2可看出前12 h幾乎沒有變化,12～48 h之間下降速度較快,48 h后下降速度相對緩慢,96 h時含量只有4.21 g/L。發(fā)酵48 h以后酸馬奶乳糖含量變化差異顯著(p<0.05)。從圖3可看出鮮馬奶中有少量的葡萄糖與半乳糖,加入發(fā)酵劑后含量增多,隨后迅速被消耗,在后續(xù)的發(fā)酵過程中變化幅度不大,處于很低的水平,甚至60 h后未檢測到葡萄糖。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳糖酶使乳糖分解成葡萄糖和半乳糖,進而轉(zhuǎn)化為乳酸和其它有機酸。研究結(jié)果表明酸馬奶發(fā)酵過程中乳糖迅速降解,48 h時分解50%,96 h時僅剩下20%。但是發(fā)酵過程中葡萄糖和半乳糖含量沒有迅速增加,表明在發(fā)酵過程中葡萄糖、半乳糖利用速度大于生成速度。

圖2　酸馬奶發(fā)酵過程中乳糖變化趨勢 Fig.2　The trend of Lactose in the fermentation process of Koumiss

圖3　酸馬奶發(fā)酵過程中葡萄糖、半乳糖變化趨勢 Fig.3　The trend of glucose,galactosen in the fermentation process of Koumiss

2.1.3乳酸、乙酸、丙酸、丁酸圖4可知,酸馬奶發(fā)酵36 h內(nèi)乳酸含量增長迅速,接著出現(xiàn)一個短暫的負增長后又恢復(fù)增長并且趨于平穩(wěn)。在96 h內(nèi)乳酸含量自0.225%增至3.29%,變化差異顯著(p<0.05),表明大量的乳糖被微生物酵解為乳酸。乳糖、乳酸在發(fā)酵過程中的變化趨勢與殷文政[4]的研究結(jié)果一致。

圖4　酸馬奶發(fā)酵過程中乳酸、乙酸、丙酸變化趨勢Fig.4　The trend of lactic acid、acetic acidand propionic acid in the fermentation process of Koumiss

酸馬奶發(fā)酵過程中有低量的乙酸生成,平均0.04%,60 h后變化差異顯著(p<0.05)。由于乙酸是易揮發(fā)性有機酸,所得檢測含量可能低于實際產(chǎn)出量。酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇與乳酸、乙酸等發(fā)生酯化反應(yīng),也會降低其含量。

丙酸在發(fā)酵前期無變化,在60 h后有明顯的增加和下降的波動變化,差異顯著(p<0.05),96 h時濃度為1.10%。丁酸在各個時期都未檢測到。

2.1.4pH變化對三組平行樣品的酸度檢測,統(tǒng)計分析其變化趨勢,如圖5所示。鮮馬奶的pH接近7,加上發(fā)酵劑后pH下降,但仍然高于6。在發(fā)酵36 h內(nèi)下降相對較快,變化差異顯著(p<0.05),之后下降速度緩慢趨于穩(wěn)定,最低達到pH=3.54,表明酸馬奶后期發(fā)酵環(huán)境酸度較高。

圖5　酸馬奶發(fā)酵過程中pH變化趨勢Fig.5　The trend of pH in the fermentation process of Koumiss

2.2酸馬奶發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化

2.2.1細菌16S rRNA基因序列分析對于酸馬奶樣品中細菌16S rRNA基因V1-V3區(qū)序列PCR擴增產(chǎn)物進行454焦磷酸高通量測序,18個樣品共產(chǎn)生67514條高質(zhì)量基因序列,每個樣品平均產(chǎn)生3750條。經(jīng)過PyNAST alignment 和100%序列鑒定聚類分析后,共得到11456條代表性序列。繼而根據(jù)序列的97%相似性進行分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)劃分及嵌合體檢查,得到477個OTUs進行下一步分析。

2.2.2基于屬水平的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細菌群落結(jié)構(gòu)采用RDP數(shù)據(jù)庫同源性序列比對與聚類相結(jié)合的方法對序列進行分類鑒定,共得到54個屬,有0.25%的序列不能鑒定到屬水平,表明酸馬奶發(fā)酵過程中細菌具有豐富的多樣性,還有發(fā)現(xiàn)新的菌種的可能性。

細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示在酸馬奶傳統(tǒng)制作過程中乳桿菌屬(Lactobacillus,51.06%)為優(yōu)勢細菌屬,乳球菌屬(Lactococcus,30.29%)為次優(yōu)勢細菌屬,其后是醋酸菌屬(Acetobacter,7.13%)。殷文正[4]在其研究中也發(fā)現(xiàn)酸馬奶發(fā)酵過程中乳桿菌屬為優(yōu)勢細菌屬。酸馬奶發(fā)酵過程中乳桿菌屬、乳球菌屬與醋酸菌屬動態(tài)變化情況如圖6所示,在發(fā)酵起始12 h后乳桿菌屬的繁殖速度加快,此時環(huán)境中酸度值能夠滿足其啟動生長,24 h后其含量又呈現(xiàn)出下降的趨勢,可能是菌群大量繁殖后出現(xiàn)了養(yǎng)分競爭而抑制了繁殖速度。與此相比,發(fā)酵起始后酸馬奶中乳球菌屬繁殖速度較快,至12 h后隨著乳桿菌屬數(shù)量增多其繁殖速度開始下降,當乳桿菌屬自24 h開始數(shù)量下降時其繁殖速度又升高。72 h后乳桿菌屬數(shù)量增加,而乳球菌屬數(shù)量減少,在發(fā)酵過程中可能兩者之間存在某種相互作用;酸馬奶發(fā)酵起始所含醋酸菌屬數(shù)量在發(fā)酵過程中減少,在48 h后其數(shù)量明顯增多,72 h后又開始下降。乳球菌屬與醋酸菌屬在發(fā)酵24 h后發(fā)酵過程中的變化趨勢相似。

圖6　基于屬水平的不同發(fā)酵時間點酸馬奶主要細菌屬豐度變化Fig.6　The trend of main bacterial content based on genus levels at different time in the fermentation process of Koumiss

3　結(jié)論

酸馬奶發(fā)酵過程中細菌相呈現(xiàn)多樣性,其中優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬,其次為乳球菌屬。發(fā)酵過程中不同細菌屬之間存在明顯的演替變化以及相互作用。

發(fā)酵過程中乳糖含量減少,而乳酸含量增多,兩者變化非常明顯。葡萄糖、半乳糖、乙酸、丙酸含量較低,無明顯動態(tài)變化。蛋白質(zhì)、脂肪含量較高,存在一定的動態(tài)變化。

總而言之,研究結(jié)果表明不同發(fā)酵時間酸馬奶營養(yǎng)價值存有差異。作為酸馬奶發(fā)酵過程研究初探所得結(jié)果有限,還需開展氨基酸、脂肪酸、風味物質(zhì)、乙醇、真菌微生物等在發(fā)酵過程中的狀態(tài)研究,為高品質(zhì)的酸馬奶開發(fā)提供依據(jù)。

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Analysis of physicochemical parameters and bacteria community structure in the Koumiss’s fermentation process

Burenqiqige1,2,GAO Ya-han1，+,BAO Yan-qing1,REN Xiu-juan1,WEI Rui-yuan1,Sarula1,ZHAO Yi-ping1,Dugarjaviin Manglai1,*

(1.College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University;Inner Mongolia Mongolian horse genetic resources protection and industrial engineering laboratory,Hohhot 010018,China;2.Department of Basic Medical,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010110,China)

To analyze the physicochemical parameters and bacteria community structure in the Koumiss’s fermentation process(0～96 h). The main findings were introduced in following part. During the fermentation process,the pH value of Koumiss was declined at high speed in early period and then the decent speed was slowed down and finally reached to the minimum value(pH=3.54). The total contents of protein and fats were fluctuant changed,and achieved to the maximum values at 72 h. The content of lactose was decreased,while the lactic acid was increased in the process of fermentation. The contents of glucose,galactose,acetic acid,and propionic acid were at low level during fermentation. The results of bacterial community structure analysis showed that there were abundant bacterial diversity and their dynamic community structures changed obviously in the Koumiss fermentation process.Lactobacilluswas the dominant bacterial genus. Its content showed a rising trend during 12 h to 24 h,while decling at 24 h to 48 h. The result showed that there were differences in nutritional value of Koumiss at different fermentation period.

Koumiss;fermentation process;physicochemical parameters;bacterial community structure

2016-01-29+為并列第一作者

布仁其其格(1982-)，女，博士研究生，講師，研究方向：分子數(shù)量遺傳學(xué)，E-mail:qiqigejin@163.com。

高雅罕(1986-)，女，博士研究生，研究方向：分子數(shù)量遺傳學(xué)，E-mail:gaoyahan_999@126.com。

芒來(1962-)，男，博士，教授，研究方向為：分子數(shù)量遺傳學(xué)與馬的育種，E-mail:dmanglai@163.com。

國家科學(xué)技術(shù)部對俄科技合作專項(2011DFR30860)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳重點實驗室建設(shè)項目(20130902)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目(20140172)；呼和浩特市科技計劃項目(2014-農(nóng)-16)。

TS252.56

A

1002-0306(2016)11-0118-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.016