盛　莉,康延海

(海南省人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科一區(qū),海南 ?？?70311)

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生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2表阿霉素敏感性的影響

盛莉,康延海

(海南省人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科一區(qū),海南 ?？?70311)

表阿霉素是一種抗生素類抗腫瘤藥物，臨床應(yīng)用廣泛，可用于胃癌、肝癌、惡性淋巴瘤等疾病治療。該藥物通過(guò)抑制胞內(nèi)遺傳物質(zhì)增殖來(lái)發(fā)揮功效，肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，HepG-2是肝組織的腫瘤細(xì)胞，有效抑制該細(xì)胞的增值是肝癌病情控制的關(guān)鍵。相關(guān)報(bào)道[1]指出單一化療藥物容易使患者產(chǎn)生耐藥性，且不良反應(yīng)較多，目前聯(lián)合用藥抑制肝癌細(xì)胞增值成為臨床應(yīng)用熱點(diǎn)。生脈注射液是從傳統(tǒng)經(jīng)典方劑生脈飲基礎(chǔ)上制成的中成藥，多數(shù)研究[2,3]提示其聯(lián)合化療藥物可提高機(jī)體免疫功能，減輕毒副反應(yīng)。本研究探討生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2表阿霉素敏感性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1研究材料

試劑：RPMll640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、豬胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，注射用鹽酸表柔比星(表阿霉素，輝瑞制藥有限公司)，生脈注射液(山西太行藥業(yè)股份有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)AMRESCO公司)，凱基AnnexinV-FITC檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)。主要儀器：酶標(biāo)儀(奧地利安托斯儀器公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)DB公司)。細(xì)胞株：人肝癌HepG-2細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將肝癌HepG-2細(xì)胞放于100ml/L小牛血清、100Μ/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37度恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)至80%-90%用豬胰蛋白酶溶液消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌HepG-2細(xì)胞，將其接種于24孔板，培養(yǎng)24h，將細(xì)胞分成對(duì)照組(正常條件)、給藥1組(30μl/ml生脈注射液)、給藥2組(0.03μg/ml表阿霉素)、給藥3組(30μl/ml生脈注射液+0.03μg/ml表阿霉素)，僅需培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG-2細(xì)胞，用豬胰蛋白酶進(jìn)行消化，將DMEM稀釋成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/ml，將其接種于96孔板，培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)基去掉，對(duì)照組(正常培養(yǎng))，給藥1組(生脈注射液，體積分?jǐn)?shù)0、10、20、50、100、200μl/ml)，給藥2組(表阿霉素作用HepG-2細(xì)胞，濃度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml)，給藥3組(30μl/ml生脈注射液聯(lián)合濃度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml表阿霉素)，培養(yǎng)72h，每孔加入20μl5mg/mlMTT，培養(yǎng)4h，棄掉孔中培養(yǎng)基，加150μlDMSO，震蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(492nm)。每組重復(fù)試驗(yàn)5次，計(jì)算藥物IC50值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1凋亡作用

對(duì)照組24h存活HepG-2細(xì)胞92.8%，給藥1組、2組和3組藥物作用24h后存活HepG-2細(xì)胞分別占93.6%、58.5%、35.4%，給藥2組和3組細(xì)胞存活率明顯少于給藥1組和對(duì)照組(P<0.05)，給藥1組同對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2增敏效果

單用表阿霉素作用的IC50為(0.043±0.013)/(μg·ml-1)，聯(lián)合生脈注射液后表阿霉素IC50(0.003±0.001)/(μg·ml-1)，增效約14倍，具體見(jiàn)表2。

表1　生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對(duì)肝癌 HepG-2 細(xì)胞凋亡作用

表2　生脈注射液對(duì)表阿霉素作用于肝癌細(xì)胞HepG-2的增敏效果

3　討論

通過(guò)MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生脈注射液對(duì)HepG-2有一定抑制作用，但需較高藥物體積分?jǐn)?shù)才能發(fā)揮抑制效果，低體積分?jǐn)?shù)生脈注射液對(duì)腫瘤細(xì)胞存活無(wú)顯著性影響，該結(jié)果和李斌[4]文獻(xiàn)中所得到的結(jié)果相一致。已有報(bào)道[5]對(duì)生脈注射液的增效減毒作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在不同腫瘤細(xì)胞中的增效作用各異。

本研究探討了生脈注射液對(duì)表阿霉素的增敏作用。通過(guò)流式細(xì)胞分析，單用生脈注射液細(xì)胞凋亡率4.7%，同正常培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異，該結(jié)果說(shuō)明低體積分?jǐn)?shù)生脈注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞的傷害微小。單用表阿霉素作用HepG-2細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率40.5%，可證實(shí)表阿霉素對(duì)HepG-2細(xì)胞有較好的殺傷作用，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表阿霉素作用機(jī)制是嵌入到脫氧核糖核酸堿基對(duì)之間，以此來(lái)干擾DNA轉(zhuǎn)錄，對(duì)信使RNA的形成受到抑制，同時(shí)還可以抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ[6]，是治療肝癌的重要藥物之一。生脈注射液聯(lián)合表阿霉素作用HepG-2細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率達(dá)到64.1%，提高約20%，說(shuō)明生脈注射液可能促進(jìn)了表阿霉素抑制腫瘤增值的作用。生脈注射液的主要成分是紅參、麥冬、五味子，紅參主要含人參皂苷，相關(guān)研究指出人參皂苷對(duì)人肝癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用，Rh2可抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散[7]，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，同時(shí)可改善心肌功能。而表阿霉素的主要毒副作用是心肌傷害[8]，其正好用以減輕該傷害。麥冬主要含多種甾體皂苷，其主要用于抗腫瘤、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)等方面。五味子主要含聯(lián)苯環(huán)辛烯類物質(zhì)，主要是五味子乙素，五味子乙素可上調(diào)細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制，廣泛保護(hù)機(jī)體組織。相關(guān)研究[9]指出人參皂苷Rb1和五味子乙素可改變P-gp蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性，適合配伍抗腫瘤藥物使用。生脈注射液成分的上述作用提示其對(duì)抗腫瘤藥物可能有好的增敏作用，研究進(jìn)一步分析了生脈注射液對(duì)表阿霉素的增敏作用，配伍用藥后表阿霉素的IC50值明顯降低，增效近14倍，說(shuō)明配伍生脈注射液后，提示小劑量的表阿霉素就可以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，這樣就可以減少表阿霉素的用藥劑量，減輕不良反應(yīng)，這對(duì)肝癌患者的臨床治療有重要的意義。表阿霉素作為抗腫瘤的有效藥物，療效較好，但心肌毒性較大，限制了其在臨床上的應(yīng)用[10]。

[1]苗苗，李嵚，劉雅茹.生脈注射液對(duì)不同化療藥物的增敏作用[J].中草藥，2013，44(7):875.

[2]王偉，姚朝輝.生脈注射液對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療毒副反應(yīng)及免疫功能的影響[J]．臨床肺科雜志,2012,17(5):876.

[3]張力，龔明玉，李毅學(xué)，等．放療聯(lián)合熱療誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其與Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)關(guān)系的研究[J]．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(20)：627．

[4]李斌.干擾TIGAR基因增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素化療敏感性的機(jī)制研究[D].鄭州大學(xué)附屬二院，2011.

[5]YinQH,YanFX,ZuXY,etal.Anti-proliferativeandpro-apoptoticeffectofcarvacrolonhμmanhepatocellμlarcarcinomacelllineHepG-2[J].Cytotechnology,2012,64(1):43.

[6]凌華毓，顧康生．尼妥珠單抗聯(lián)合表阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2體外生長(zhǎng)的影響[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(2) ：113.

[7]WangB1,Xμnsun,LiuJY,etal.TheeffectofcellcycleandexpressionofcyclinB1andcyclinCproteininhepatocellμlarcarcinomacelllineHhepG2andSMMC-7721aftersilencingβ-cateningene[J].Hepatogastroenterology,2012,59(114):515.

[8]肖廣顯，丁素銀，程英俊，等．索拉非尼聯(lián)合熱療對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞中Bax，Bcl-2表達(dá)的影響[J]．解放軍醫(yī)藥雜志，2011，23(5)：1.

[9]朱開(kāi)梅，李美波，駱彩珍，等.構(gòu)樹(shù)葉總黃酮對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖及其細(xì)胞周期的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(3):153.

[10]VanGeelenCM,PennarunB,EkWB,etal.Downregulationofactivecaspase8asamechanismofacquiredTRAILresistanceinmismatchrepair-proficientcoloncarcinomacelllines[J].IntJOncol,2010,37(4):1031．

海南省自然科學(xué)基金(SQ2014ZRJJ0136)

1007-4287(2016)08-1325-02

2016-02-18)