滿建梅，郭軍堂，張代娟，陳安琪

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濰坊　261053)

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A53T α-synuclein抑制SH-SY5Y細(xì)胞2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)

滿建梅，郭軍堂，張代娟，陳安琪

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濰坊261053)

目的研究穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(VMAT2)蛋白表達(dá)的影響。方法構(gòu)建A53Tα-synuclein真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞株；分別采用 Western blotting及DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞系A(chǔ)53T α-synuclein過(guò)表達(dá)對(duì)VMAT2蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)水平的影響。結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示VMAT2的表達(dá)在穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein的細(xì)胞系中明顯降低。DCFH-DA染色結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein細(xì)胞系內(nèi)DCF signal (507.3±7.1)較對(duì)照組 (410.7±10.5)明顯增多 (P<0.05)。結(jié)論A53T α-synuclein能夠通過(guò)抑制VMAT2的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,在帕金森病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

帕金森氏??；A53T α-synuclein；VMAT2

帕金森氏病(Parkinson′s disease, PD)的主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性及Lewy body(LB)的形成，α-synuclein是LB的重要成分[1]。A53T α-synuclein是人們?cè)诔Ｈ旧w顯性家族PD患者中發(fā)現(xiàn)的突變體[2]，與PD的發(fā)病密切相關(guān)，但具體機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)A53T α-synuclein可與VMAT2在體外發(fā)生特異性分子間相互作用[3]，提示A53T α-synuclein參與了多巴胺(DA)的代謝調(diào)節(jié)過(guò)程，在PD的多巴胺神經(jīng)元選擇性變性過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究目的是建立穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein的細(xì)胞系，并研究其對(duì)VMAT2蛋白表達(dá)的影響， 為研究PD的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料

神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心；攜帶A53T α-synuclein的T載體及β-半乳糖苷酶的pcDNA3.0-Lacz真核細(xì)胞表達(dá)載體為本室保存；LipofectamineTM2000購(gòu)自Gibco BRL；山羊抗人VMAT2多克隆抗體、小鼠抗人α-synuclein多克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；辣根酶(HRP)標(biāo)記IgG購(gòu)自中杉金橋； XhoI、HindIII、T4DNA連接酶、高保真Pyrobest DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物；2’-7’-二氯熒光素雙醋酸鹽 ( DCFH-DA)、X-gal購(gòu)自Sigma；G418購(gòu)自Amersco；PCR引物由上海博亞公司合成。

1.2方法

1.2.1真核表達(dá)載體構(gòu)建：合成正義引物 cttcataagcttcgacagtgtggt(含HindIII內(nèi)切酶位點(diǎn))和反義引物taagatctcgaggaaactgggagcaaag(含XhoI內(nèi)切酶位點(diǎn))，以攜帶A53T α-synuclein的T載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。條件：94℃ 變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，25個(gè)循環(huán)?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pcDNA3.0分別用HindIII和XhoI酶切。酶切產(chǎn)物純化后加入T4連接酶4℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用HindIII和XhoI酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pcDNA3.0-A53T。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將SH-SY5Y接種于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)中，37℃，5% CO2培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Gibco BRL)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后加入抗生素含G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行持續(xù)篩選,兩周后挑選單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并繼續(xù)保持篩選壓力到2個(gè)月以上。穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein的細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)組，穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞系為對(duì)照組。

1.2.3β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)：培養(yǎng)細(xì)胞72 h后,用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，10%甲醛固定液室溫固定 5 min。 PBS 洗滌兩次后加入X-gal染色液(1g/L)，37 ℃ 孵 育12 h。顯微鏡下觀察，藍(lán)染細(xì)胞為表達(dá)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.4Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：胰酶消化細(xì)胞后,1 000 g離心10 min, PBS 洗3次后,棄上清液，加入1/5 體積的6×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，混勻后100 ℃煮沸10 min進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫?fù)u動(dòng)封閉1 h，一抗(VMAT2抗體1∶500，α-synuclein抗體1∶500，β-actin抗體1∶500)室溫孵育4 h，1∶5 000二抗室溫孵育1 h, ECL 化學(xué)發(fā)光與曝光。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平：培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，用胰酶進(jìn)行消化；將細(xì)胞重新懸浮于預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基中，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，孵育20 min后， 離心收集細(xì)胞，PBS重新洗滌細(xì)胞3次，最后重新懸浮于500 μL PBS， 流式細(xì)胞儀(E6155, BD FACS Calibur)中檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每次10 000個(gè)，重復(fù)3次,記錄平均DCF signal。

2　結(jié)果

2.1pcDNA3.0-A53T真核表達(dá)載體的鑒定

Hind III和XhoI雙酶切pcDNA3.0和pcDNA3.0-A53T，酶切產(chǎn)物電泳可見(jiàn)1泳道有500 bp左右大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(見(jiàn)圖1)。DNA測(cè)序結(jié)果與Genbank報(bào)道的序列一致。

M：DNA marker；1：pcDNA3.0-A53T；2：pcDNA3.0圖1　pcDNA3.0-A53T真核表達(dá)載體的酶切鑒定M: DNA marker; Lane 1: pcDNA3.0-A53T; Lane 2: pcDNA3.0.Fig.1　Identification of eukaryotic expression vector pcDNA3.0-A53T

2.2穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞系的鑒定

真核表達(dá)載體pCMVSYN-A53T沒(méi)有β-半乳糖苷酶基因，在細(xì)胞中無(wú)法產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無(wú)法作用于X-gal中的吲哚環(huán)而顯藍(lán)色。想反，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶基因的細(xì)胞系能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，細(xì)胞則有明顯的藍(lán)染，提示β-半乳糖苷酶在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。如圖2所示。

2.3Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，在SH-SY5Y細(xì)胞中有野生型α-synuclein蛋白的表達(dá)，但α-synuclein蛋白的表達(dá)量在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A53T α-synuclein的細(xì)胞系中(實(shí)驗(yàn)組)較穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞系(對(duì)照組)明顯增多，提示細(xì)胞系中有A53T α-synuclein的過(guò)表達(dá)，而VMAT2在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組明顯降低。如圖3所示。

2.4細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化

如圖4所示, 穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein細(xì)胞系的DCF signal (507.3±7.1)較穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞系(410.7±10.5)明顯增高 (P<0.05)，提示A53Tα-synuclein過(guò)表達(dá)能夠明顯增加細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

注：A：穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞系； B：穩(wěn)定表達(dá)A53Tα-synuclein細(xì)胞系圖2　X-gal染色檢測(cè)β-半乳糖苷酶的表達(dá)Note. A: Cells stably expressing β-galactosidase; B: Cells stably expressing A53T α-synuclein.Fig.2　The detection of β-galactosidase by X-gal staining

注：實(shí)驗(yàn)組：穩(wěn)定表達(dá)A53Tα-synuclein細(xì)胞系；對(duì)照組：穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞系圖3　Western blotting檢測(cè)A53T α-synuclein及VMAT2的表達(dá)Note. Experimental group: Cells stably expressing A53T α-synuclein. Control group: Cells stably expressing β-galactosidase.Fig.3　Expression of A53T α-synuclein and VMAT2 detected by Western blotting

圖4　細(xì)胞系內(nèi)ROS水平的變化Fig.4　Changes of intracellular ROS level

3　討論

α-Synuclein是一種具有非β-淀粉樣結(jié)構(gòu)(NAC)的可溶性蛋白質(zhì)，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢和核周，在突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及多巴胺的代謝過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[4，5]。α-Synuclein蛋白正常、錯(cuò)誤折疊及其寡聚化之間存在動(dòng)態(tài)平衡，失衡后如出現(xiàn)大量錯(cuò)誤折疊，會(huì)導(dǎo)致寡聚體及纖維體的形成。Peelaerts W等[6]認(rèn)為纖維態(tài)是主要的毒性物質(zhì)，它可引起進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能損害和細(xì)胞死亡，具體的機(jī)制尚不清楚。目前研究認(rèn)為導(dǎo)致PD發(fā)病的重要因素可能與DA異常代謝產(chǎn)生的ROS有關(guān)，它能夠引起神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損害[7]。細(xì)胞內(nèi)的DA，尤其是DA的代謝產(chǎn)物能夠與α-synuclein相互作用，促進(jìn)α-synuclein的異常聚集及纖維化，形成LB小體[8]。生理?xiàng)l件下，多巴胺一旦在神經(jīng)元中合成，立即可以通過(guò)VMAT2轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸囊泡中進(jìn)行儲(chǔ)存，否則中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的DA能夠通過(guò)自身氧化和酶降解產(chǎn)生ROS[9]。

本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)顯示A53T α-synuclein在SH-SY5Y細(xì)胞系中穩(wěn)定高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究PD發(fā)病機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型。在穩(wěn)定表達(dá)A53T α-synuclein細(xì)胞系中的VMAT2表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，提示其有抑制VMAT2蛋白表達(dá)的作用。為了進(jìn)一步探討A53T α-synuclein抑制VMAT2表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞系產(chǎn)生的影響，我們通過(guò)DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，結(jié)果顯示A53T α-synuclein過(guò)表達(dá)能夠明顯的增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，這可能與其抑制VMAT2的表達(dá)有密切的關(guān)系。據(jù)此，我們認(rèn)為過(guò)表達(dá)的A53T α-synuclein作用于VMAT2，下調(diào)其蛋白表達(dá)水平，打破了細(xì)胞內(nèi)DA的平衡，致使細(xì)胞內(nèi)ROS累積，造成對(duì)細(xì)胞的損害。A53Tα-synuclein如何影響VMAT2基因的表達(dá)及具體功能有待于進(jìn)一步研究。

[1]Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM, et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies [J]. Nature， 1997, 388(6645): 839-840.

[2]Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson′s disease [J]. Science， 1997, 276(5321): 2045-2047.

[3]陳安琪，王建英，牟青杰, 等. A53Tα-synuclein與II型單胺囊泡轉(zhuǎn)移體相互作用的鑒定[J]. 中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué), 2008(7): 43-45.

[4]Lashuel HA1, Overk CR, Oueslati A, et al. The many faces of α-synuclein: from structure and toxicity to therapeutic target [J]. Nat Rev Neurosci， 2013, 14(1): 38-48.

[5]Venda LL1, Cragg SJ, Buchman VL, et al. α-Synuclein and dopamine at the crossroads of Parkinson′s disease [J].Trends Neurosci， 2010, 33(12): 559-568

[6]Peelaerts W, Bousset L, Van der Perren A, et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration [J]. Nature， 2015, 522(7556): 340-344.

[7]Jenner P, Olanow CW. Understanding cell death in Parkinson′s disease [J]. Ann Neurol， 1998, 44(3 Suppl 1): S72-84.

[8]Follmer C, Rom?o L, Einsiedler CM, et al. Dopamine affects the stability, hydration, and packing of protobrils andbrils of the wild type and variants of α-synuclein [J].Biochemistry, 2007, 46(4): 472-482.

[9]Parsons SM. Transport mechanisms in acetylcholine and monoamine storage [J]. FASEB J， 2000, 14(15): 2423-2434.

A53T α-synuclein decreases the expression of type 2 vesicular monoamine transporter in neuroblastoma SH-SY5Y cells

MAN Jian-mei, GUO Jun-tang, ZHANG Dai-juan, CHEN An-qi

(School of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo investigate the effect of A53T α-synuclein on the expression of type 2 vesicular monoamine transporter (VMAT2) in neuronblastoma SH-SY5Y cells stably expressing A53T α-synuclein. Methods A53T α-synuclein eukaryotic plasmid was constructed by transfection of the SH-SY5Y cells using LipofectamineTM2000, and a stable transfected monoclonal cell line was selected by G418. Western blotting and DCFH-DA staining were used to detect the effect of A53T α-synuclein overexpression on the expression of VMAT2 protein and level of reactive oxygen species (ROS). ResultsWestern blotting showed that compared with the control group, the expression of VMAT2 protein was significantly decreased, and DCFH-DA staining showed that DCF signal was significantly increased (507.3±7.1) than that in the cell line stably expressing A53T α-synuclein (410.7±10.5) (P<0.05). ConclusionsA53T α-synuclein can increase the intracellular ROS level by inhibiting the expression of VMAT2, thereby playing an important role in the pathogenesis of Parkinson′s disease.

Parkinson′s disease; A53T α-synuclein; VMAT2

山東省自然科學(xué)基金(ZR2011HM014)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HL126)。

滿建梅(1989-)，女，碩士研究生，專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)。Email:1192746984@qq.com。

陳安琪(1981-)，女。Email: chenanqi_1981@163.com。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0066-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.010

2016-03-09