顧東曙，陳傍柱，江　霞，劉海月，那順巴雅爾，周宏偉，顧為望

(1.南方醫(yī)科大學實驗動物中心，廣州　510515；2.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院，廣州　510515；3.廣東醫(yī)科大學，東莞　523808； 4.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州　510282)

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應用16S rRNA高通量測序法比較人與常用實驗動物口腔菌群的異同

顧東曙1，陳傍柱1，江霞1，劉海月2，那順巴雅爾3，周宏偉4，顧為望

(1.南方醫(yī)科大學實驗動物中心，廣州510515；2.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院，廣州510515；3.廣東醫(yī)科大學，東莞523808； 4.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州510282)

目的應用16S rRNA高通量測序法測定幾種常用實驗動物(西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭兔、Wistar大鼠)的口腔菌群，并和人的口腔菌群進行對比分析，為口腔微生態(tài)的動物模型研究提供基礎性資料。方法用一次性棉拭子采集西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭兔、Wistar大鼠和人的口腔菌群標本，提取樣品總DNA，使用帶標簽的通用引物擴增16S rRNA V4區(qū)片段，Illumina 測序，經(jīng)BIPES 以及QIIME 分析比較菌群多樣性及結(jié)構(gòu)。結(jié)果人與5種常用實驗動物口腔菌群的豐富度均差異顯著(P<0.05)，不同種類動物有其各自獨特的口腔菌群，但猴的口腔菌群與人最為相似。結(jié)論根據(jù)與人口腔某類菌群的相似程度，5種動物中，猴口腔的梭菌屬(Fusobacterium)、卟啉菌屬(Porphyromonas)水平與人最相似，提示猴可能是研究人口腔菌群較適宜的模型動物。從特定菌門角度，西藏小型豬可能是研究與變形菌門(Proteobacteria)相關(guān)疾病的較適宜模型動物；比格犬可能是研究與螺旋體門(Spirochaetes)相關(guān)疾病的較適宜模型動物。

實驗動物；口腔菌群；16S rRNA；西藏小型豬；比格犬；獼猴；新西蘭兔；Wistar大鼠

口腔菌群是由大量口腔微生物組成的復雜生態(tài)體系，口腔內(nèi)適宜的溫度、濕度、豐富的營養(yǎng)來源以及復雜的結(jié)構(gòu)，為口腔內(nèi)各種微生物的生長、繁殖和定居提供了便利條件，形成了口腔微生物的多樣性[1]。口腔內(nèi)微生物的多樣性有利于維持口腔健康，抵御外界不良因素對機體的侵襲。一旦微生物群落失調(diào)，則可導致齲病、牙周病以及口腔潰瘍等口腔疾病[2]。微生物的多樣性及結(jié)構(gòu)研究是進行復雜微生態(tài)系分析的基礎，通過分析口腔中微生物豐度與結(jié)構(gòu)的變化，能夠揭示口腔疾病發(fā)生與微生物群落之間的關(guān)系，從而為預防和治療口腔疾病提供合理的理論依據(jù)[3, 4]。細菌16S rRNA基因在所有細菌的基因組中存在，是編碼rRNA相對應的DNA序列，在長時間的進化過程中，rRNA分子有些部位的序列變化非常緩慢，具有高度的保守性，基于這些序列的高度保守性可以檢測細菌種系上的深遠關(guān)系；同時，16S rRNA又具有9個高度可變區(qū)，V1至V9可變區(qū)(本研究中選擇了V4可變區(qū))，可變區(qū)序列因細菌不同而異，保守區(qū)和可變區(qū)交錯排列。通?；诒Ｊ貐^(qū)序列設計引物，PCR擴增，得到16S rRNA擴增片段，再利用可變區(qū)序列的差異實現(xiàn)對細菌種屬的分類、鑒定。運用高通量測序技術(shù)測序，將高通量測序序列與基因數(shù)據(jù)庫(或特定序列)進行比對，將一定相似度的菌屬歸為某種特定菌屬，可實現(xiàn)對菌屬快速、準確地分類鑒定，目前這種方法是研究口腔微生物多樣性最為廣泛，最為有效的手段之一。本研究通過課題組前期基于16S rRNA建立的Illumina 雙末端測序法(BIPES)[4, 5]，并采用QIIME比較分析幾種常用實驗動物與人的口腔菌群結(jié)構(gòu)，為口腔疾病模型動物的選擇提供數(shù)據(jù)基礎。

1　材料和方法

1.1耗材

一次性棉拭子(蘇州康健醫(yī)療器械有限公司)、各種型號EP管等耗材(上海Sangon公司)、口腔拭子基因組DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、Ex-taq酶(寶生物工程大連有限公司)。

1.2實驗動物

成年普通級西藏小型豬(簡稱“豬”)：東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司提供(許可證號：SCXK(粵)2012-030)；成年普通級獼猴(簡稱“猴”)：南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(粵)2014-0025)；成年普通級比格犬(簡稱“犬”)：西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供(許可證號：SCXK(陜)2014-001)；成年SPF級新西蘭大白兔(簡稱“兔”)：南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供(SCXK(粵)2011-0015)；成年SPF級Wistar大鼠(簡稱大鼠)：南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供(SCXK(粵)2011-0015)。

1.3方法

1.3.1樣品采集：一次性棉拭子采集成年豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群樣品，每個品種4只，雄性1只，雌性3只；40～60歲健康人群口腔樣本10個，男性5個，女性5個。所有樣品-20℃保存。

1.3.2樣品總DNA提取：按照北京百泰克生物技術(shù)有限公司口腔拭子基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取樣品總DNA，置于-20℃保存。

1.3.3細菌16S rRNA基因擴增：選擇帶標簽的通用引物擴增16S rRNA V4區(qū)域，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，引物上游：V4F-5′-GAGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，引物下游：V4R252-5′-TTAGGAGACCCGGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′。每個樣品對應相應的帶標簽上下游引物信息，PCR擴增體系為25 μL(表1)。PCR擴增條件：94℃，2 min；94℃，30 s；52℃，45 s；72℃，30 s；30個循環(huán)；72℃，5 min；4℃保存。

表1　PCR反應體系

1.3.4Illumina Solexa測序：為盡量避免因PCR擴增造成各樣品濃度差異對后續(xù)基因測序深度的影響，樣品上機測序之前進行凝膠電泳檢測，利用凝膠分析軟件BandScan以DNA Marker (2 000 bp) 200 bp條帶為基準對DNA樣品進行相對定量，確保盡量以相等的終溶度混合樣品，然后將標準品(細菌質(zhì)粒)加入樣品PCR產(chǎn)物，以同等比例的終濃度混合均勻。Illumina HiSeq 2000測序平臺進行高通量測序[5]。

圖1　常用實驗動物與人口腔菌群PD _whole_tree(A)和Shannon 指數(shù)(B)Fig.1　PD_whole_tree (A) and Shannon index (B) of oral flora in commonly used laboratory animals and humans

1.3.5數(shù)據(jù)分析：高通量測序數(shù)據(jù)用BIPES (Barcoded Illumina Paried-end Sequencing) 流程進行初步原始序列處理[6]，。BIPES流程將堿基拼接和序列分析分為了兩部分，一部分是使用mothur進行序列的挑揀，去除復雜的嵌合體序列，得到干凈的序列，進而進入下一步的QIIME分析，包括alpha多樣性，beta多樣性和RDP聚類分析等。

使用TSC聚類將微生物進行界門綱目科屬種的分類。并采用分階段聚類算法RDP (Ribosomal Database Project, RDP)[7]將序列聚類成最小操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，當細菌16S rRNA基因序列之間的距離在0.03以內(nèi)，把它們視為同一個種屬。對于獲得的OTUs，使用對其進行分類注釋。用mothur軟件[8]進行測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析，去除錯誤序列和嵌合體。采用QIIME對樣本PD_whole_tree、Shannon等多樣性指數(shù)分析，從而分析樣品的α多樣性，即單個樣品包含種屬結(jié)構(gòu)的多樣性；基于UniFrac距離[8]，進行主成分分析[9]，分析β多樣性；采用線性判別式分析效應值(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)[10]，Galaxy89在線工具尋找不同組別之間有統(tǒng)計學差異的菌群標志物。應用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用One-Way ANOVA進行Bonferroni法兩兩比較分析或Kruskal-Wallis One-way ANOVA進行兩兩比較，校正檢驗水準。采用GraphPad prism5軟件工具對PD_whole_tree、Shannon等作圖。

2　結(jié)果

2.1測序與質(zhì)量控制

35個樣品質(zhì)控后共獲取了939272條16S rRNA基因序列，所有樣品全部納入后續(xù)分析。

2.2常用實驗動物與人口腔菌群比較分析

2.2.1α多樣性分析：α多樣性通常是指群落內(nèi)的物種豐度和均勻度。PD_whole_tree指觀察到的種屬數(shù)，反映菌落內(nèi)的豐度；Shannon指數(shù)則受到菌落豐度和均度兩者的影響。

圖1 A顯示：人與豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群的α多樣性，即菌群豐度差異顯著(P<0.05)；豬與犬、猴、兔口腔菌群的豐度差異顯著(P<0.05)，其他動物間均無顯著差異(P>0.05)；該結(jié)果提示，豬的口腔菌群多樣性最低，人次之，其他4種動物口腔菌群物種豐富程度相對較高。圖1 B顯示：人、豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群Shannon指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

圖2　常用實驗動物與人口腔菌群加權(quán)Unifrac距離(A1，A2)和未加權(quán)Unifrac距離(B1，B2)Fig.2　Weighted UniFrac distance (A1，A2) and unweighted UniFrac distance B1，B2) of oral flora in commonly used laboratory animals and humans

2.2.2 β多樣性分析：β多樣性研究群落之間菌落的相似性關(guān)系，圖2(A1、B1)中一個點表示一個樣品，樣品之間的距離代表樣品之間的相似度，距離越近，相似度越高。加權(quán)UniFrac距離在未加權(quán)的基礎上增加了菌群的豐度。圖2顯示：除人之外，幾個常用實驗動物的樣品間距離較近，相似度較高；無論加權(quán)和未加權(quán)Unifrac距離中，猴與人的距離相對較近(見圖2中A2、B2)，表明猴的口腔菌群相對于其他種類動物與人更相似，猴可能是研究人口腔菌群較適宜的模型動物。

圖3　常用實驗動物與人口腔菌群結(jié)構(gòu)門水平分布Fig.3　Distribution of oral flora at phylum level in commonly used laboratory animals and humans

2.2.3口腔菌群結(jié)構(gòu)組成：

2.2.3.1菌群結(jié)構(gòu)門水平：圖3顯示：人、豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群均以放線菌門(Actinobacillus)、擬桿菌門(Bacteroides)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，均占80%以上；人的口腔菌群中，放線菌門(Actinobacillus)、擬桿菌門(Bacteroides)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和梭桿菌門(Fusobacterium)五個門的細菌占主要地位，高達97.1%，在五種實驗動物中，猴以上五個菌門的水平與人最相似；猴的梭桿菌門(Fusobacteria)比其它幾種動物與人更相似；豬的變形菌門(Proteobacteria)顯著高于人與其它幾種動物；犬的螺旋體門(Spirochaetes)顯著高于人和其它幾種動物。

2.2.3.2菌群結(jié)構(gòu)屬水平：

從圖4可以看出，人與不同種類實驗動物的口腔菌群在屬水平上均差異較大。人口腔中數(shù)量最多的是普氏菌屬(Prevotella)，這種菌屬在豬、犬、猴、兔、鼠的口腔中均分布較少；豬、猴、兔、鼠的口腔菌群中均含有鏈球菌，猴口腔的鏈球菌含量最高；五種動物中，猴口腔菌群中梭菌屬(Fusobacterium)、卟啉菌屬(Porphyromonas)與人最相似。

2.2.4不同物種口腔菌群的統(tǒng)計學分析及生物標志物：

為進一步確定菌群種屬的豐富度差異，采用在線統(tǒng)計工具LEfSe來確定人與5種動物的差異菌屬，LDA值設置為4。結(jié)果表明：人的普氏菌屬(Prevotella)(從門到屬)、梭菌屬(Fusobacterium)(從門到屬)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)豐富度較高；猴的鏈球菌屬(Streptococcus)(從門到屬)、棒桿菌屬(Corynebacterium)(從科到屬)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)(從目到科)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、放線桿菌屬(Actinobacillus)豐富度較高；豬的莫拉氏菌屬(Moraxella)(從門到屬)、金氏菌屬(Kingella)豐富度較高；犬的梭菌目(Clostridiales)(從綱到目)、卟啉菌屬(Porphyromonas)豐富度較高；兔的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)(從目到科)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)(從綱到目)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)(從綱到科)豐富度較高；鼠的羅氏菌屬(Rothia)(從門到屬)豐富度較高。

3　討論

圖4　常用實驗動物與人口腔菌群結(jié)構(gòu)屬水平分布Fig.4　Distribution of oral flora at genera level in commonly used laboratory animals and humans

圖5　常用實驗動物與人口腔菌群Lefse結(jié)果進化分支圖(LDA=4.0，P<0.05)Fig.5　LEfSe results of oral flora in commonly used laboratory animals and humans (LDA=4, P<0.05)

人與5種常用實驗動物口腔菌群豐度差異顯著(P<0.05)，除了物種本身影響外，可能與彼此之間的飲食、環(huán)境等多種因素有關(guān)。菌群β多樣性分析顯示：猴與人的距離相對較近，表明猴的口腔菌群相對于其他種類動物與人更相似，提示猴可能是研究人口腔菌群較適宜的模型動物。人的口腔菌群中，放線菌門、擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門5個門的細菌占主要地位，高達97.1%，在五種實驗動物中，猴以上5個菌門的水平與人最相似，這可能因為猴與人的親緣關(guān)系最近，以及人工馴養(yǎng)繁殖的猴與人的飲食較相似有關(guān)；梭桿菌門是導致人口腔疾病的重要菌門，在5種動物中，猴與人的梭桿菌門水平最相似，提示猴可能是研究人與梭桿菌門細菌相關(guān)口腔疾病的較適宜模型；變形菌門包括很多病原菌，如變形桿菌、沙門氏菌、弧菌、螺桿菌等，與口腔感染性疾病密切相關(guān)，豬的變形菌門較其它幾種動物豐富，提示豬可能是研究與變形菌門相關(guān)疾病的較適宜模型動物；螺旋體是人口腔正常菌群的一個組成部分，與牙周疾病的發(fā)生關(guān)系密切，在壞死性齦炎病變部位，可以發(fā)現(xiàn)大量的螺旋體，在慢性牙周炎的病損區(qū)也可發(fā)現(xiàn)菌斑中的螺旋體[12]，在5種動物中，只有犬口腔的螺旋體門較為豐富，提示犬可能是研究與螺旋體門相關(guān)疾病的適宜模型動物。

人口腔中數(shù)量最多的是普氏菌屬，是牙周病和牙周膿腫的致病菌[13]，這種菌屬在五種動物中均分布較少。梭菌屬可與螺旋體混合感染，會引起急性潰瘍性齦炎、急性壞死齦炎等，當人的炎癥性牙周病變得嚴重時，此二類菌數(shù)大為增加，疾病減輕時又會減少，是牙周疾病治療效果觀察指標之一；卟啉菌屬是口腔菌群中和牙周病相關(guān)的一個菌屬[14]，它可侵入人牙齦成纖維細胞，并且在相當濃度的抗生素作用下存活[15]。研究表明，它和類風濕關(guān)節(jié)炎也有一定的關(guān)聯(lián)，類風濕關(guān)節(jié)炎癥的患者普遍患有牙周疾病，并且使用抗生素的水平偏高[16]；本研究中猴口腔的梭菌屬、卟啉菌屬比其他種類動物與人更相似，提示猴可能是研究與此菌屬相關(guān)疾病的適宜模型動物。

目前，人體口腔菌群的研究較多，實驗動物與人體之間正?？谇痪旱膶Ρ妊芯窟M行的很少；某一物種下的不同條件或刺激之間的對比研究較多，不同物種之間相同條件下的比較研究較少。與以往類似的研究相比，本研究的不同之處主要在于以下兩點：以往的研究多采用2～3種實驗動物，而本研究涵蓋了醫(yī)學研究中較常用的5種常用實驗動物(豬、犬、猴、兔、大鼠)，研究的動物種類最多；以往的研究多采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，本研究采用16Sr RNA高通量測序法，能夠較為全面和準確的反映微生物群落結(jié)構(gòu),而DGGE僅能夠反映有限的優(yōu)勢微生物類群，在技術(shù)水平上具有局限性。

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Comparison of human and animal oral microbiota by Illumina sequencing of 16S rRNA tags

GU Dong-shu1， CHEN Bang-zhu1, JIANG Xia1, LIU Hai-yue2,Nashun Bayaer3, ZHOU Hong-wei4, GU Wei-wang1

(1. Laboratory Animal Center of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2. Department of Environmental Health, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University,Guangzhou 510515; 3. Guangdong Medical University, Dongguan 523808；4. Department of Laboratory Medicine of Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282)

Objective To provide original reference data for oral ecosystem research, Tibet minipigs, beagle dogs, rhesus monkey, New Zealand white rabbits and Wistar rats were selected to study their respective characteristics of oral microbial mmunities and compared with normal data of humans. Methods Total DNA was extracted from the specimens of oral microbial communities of Tibet minipigs, beagle dogs, rhesus monkey, New Zealand white rabbits and Wistar rats, and used to amplify 16S rRNA V4 fragments with labeled universal primers. The diversity and structure of microbial communities from those animals were compared with that of humans using BIPES and QIIME analysis after Illumina sequencing of 16S rRNA V4 fragments. ResultsThe richness of the oral microbial communities of humans and the five species of laboratory animals was significantly different (P<0.05). Different species of animals have their own unique oral flora, among which the oral flora of the monkey is the most similar to that of humans. ConclusionsAmong the five species of laboratory animals, the oral microbial communities of rhesus monkeys and humans have highest similarity. Specifically, the Fusobacterium and Porphyromonas levels of rhesus monkeys is most similar to those of humans. Our findings indicate that rhesus monkeys may be suitable animal model for studies of human oral microbial communities. Tibet minipigs may be suitable animal model for Proteobacteria studies, while beagle dogs may be appropriate for modeling of diseases related to Spirochaetes.

Laboratory animal; Tibet minipig; Beagle dog; Rhesus monkey; New Zealand white rabbit; Wistar rat; Oral microbiota; 16S rRNA

廣東省科技計劃項目(編號：2013B030300040，2015A030302076);東莞松山湖高新區(qū)生物醫(yī)藥外包服務基地建設(編號：2012B011000004)。

顧東曙(1979-)，女，碩士，專業(yè)：動物學。Email: 20595411@qq.com。

顧為望(1956-)，男，教授，研究方向：實驗動物培育、人類疾病動物模型制備與比較醫(yī)學。Email: guww100@163.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0096-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.016

2016-05-02