木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素關(guān)鍵工藝研究

賈志春,張　珍,張盛貴,牛黎莉,趙圓圓,肖雪莉,徐榮榮,包雪梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

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木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素關(guān)鍵工藝研究

賈志春,張珍*,張盛貴,牛黎莉,趙圓圓,肖雪莉,徐榮榮,包雪梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

利用牦牛血中豐富的血紅蛋白來(lái)制備氯化血紅素。以新鮮牦牛血為原材料,通過(guò)預(yù)處理獲得血紅蛋白,之后進(jìn)行酶解獲取氯化血紅素,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Benhnken中心組合旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,確定了酶解血紅蛋白制備氯化血紅素的(酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶添加量)最適工藝條件,結(jié)果表明,提取氯化血紅素的最佳工藝為:酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。木瓜蛋白酶對(duì)酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素有實(shí)際意義,在此工藝條件下,氯化血紅素的濃度可達(dá)6.47 μg/mL。

牦牛血,木瓜蛋白酶,氯化血紅素,響應(yīng)面法

牦牛血液中有豐富的蛋白質(zhì),蛋白含量在牦牛全血中為15.5%±0.8%,血漿中為6.9%±0.7%，血細(xì)胞中為32.7%±0.9%，是非常理想的蛋白質(zhì)資源[1-2]。血紅素是具有卟啉結(jié)構(gòu)的分子,四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)亞鐵離子配位卟啉分子中心結(jié)合,一般生命體內(nèi)每100 mL血液中鐵的含量可達(dá)40 mg,是肌肉肌紅蛋白中鐵含量的10～80倍[3]。血紅素主要存在于動(dòng)物的血液和肌肉中，是動(dòng)物血液中的天然色素,具有重要的生理功能和很高的實(shí)用價(jià)值,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、保健品、建筑及化妝品行業(yè)[4-7]。

酶法制備血紅素鐵由于不用其他有機(jī)試劑,是目前最環(huán)保的方法,吳寶承[8]等分別選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶酶解血紅蛋白,結(jié)果顯示中性效果最好。張亞娟[9]等采用預(yù)處理的血紅蛋白粉為原料分別用單一酶和復(fù)合酶酶解血紅蛋白。采用生物酶水解血紅蛋白制取富含血紅素的生物活性肽,可以有效預(yù)防缺鐵性貧血,但大多都是鹿血[10]、牛血[11]、豬血[12]血紅素提取研究,中國(guó)是牦牛的發(fā)源地之一,也是當(dāng)前世界上飼養(yǎng)牦牛數(shù)量最多的國(guó)家,全國(guó)牦牛的存欄總數(shù)大約有1400多萬(wàn)頭,大約占我國(guó)飼養(yǎng)牛[13]總數(shù)的16.67%。傳統(tǒng)方法提取的血紅素,有特殊的味道且有溶劑殘留,影響血紅素有效利用。本實(shí)驗(yàn)利用木瓜蛋白酶將牦牛血紅蛋白水解制備氯化血紅素,獲得純天然無(wú)污染小分子純度高易被人體吸收利用的血紅素,探索酶解優(yōu)化條件以期為牦牛血紅素的開(kāi)發(fā)利用提供理論研究基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮牦牛血甘肅甘南瑪曲屠宰廠;血紅素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)美國(guó)sigma公司;木瓜蛋白酶(酶活80萬(wàn)U/g)上海源葉生物科技公司;檸檬酸、甲醛、鹽酸、濃硫酸、甲醛、硫酸銅、溴甲酚綠、甲基藍(lán)、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸(國(guó)產(chǎn)分析純)。

H-1850R低溫離心機(jī);HHS型電熱恒溫水浴鍋;CJJ78-1磁力加熱攪拌器;雷磁pHS-3C酸度計(jì);DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器;電子天平;JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);K9840自動(dòng)凱氏定氮儀;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);BPZ-6063真空干燥箱。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程新鮮牦牛血→抗凝處理(5000 r/min)→沉淀紅細(xì)胞→生理鹽水洗滌→離心分離→濃縮紅細(xì)胞→超聲波破胞處理→加酶→調(diào)節(jié)pH→在不同酶解條件下(酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、酶添加量)酶解處理→滅酶→冷卻離心→牦牛血紅素

1.2.2牦牛血細(xì)胞的預(yù)處理取一定體積的牦牛血抗凝處理后,以5000 r/min離心15 min,傾出上清液,收集紅細(xì)胞。取上述紅細(xì)胞150 mL用等體積(生理鹽水)洗滌紅細(xì)胞,離心,重復(fù)2次。加入(1 mol/L的氯化鈉和10 mL無(wú)水乙醇)攪拌混勻,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(功率為0.8 kW,處理10 min)參照趙劍龍[14]的方法略有改進(jìn)。獲得細(xì)胞破碎液密封冷藏于4 ℃冰箱。

1.2.3酶水解取上述樣液加入600 mL蒸餾水參照楊錫洪[15]的方法略有改進(jìn),攪拌混勻,加入木瓜蛋白酶與一定量的還原劑半胱氨酸[16],用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH放入水浴鍋啟動(dòng)反應(yīng)。水解過(guò)程中滴加0.1 mol/L的NaOH保持pH恒定。反應(yīng)結(jié)束后,沸水浴15 min滅酶冷卻離心獲得上清液測(cè)定血紅蛋白水解度,沉淀用于氯化血紅素濃度計(jì)算。

1.3測(cè)定方法

1.3.1水解度的測(cè)定水解度(DH)測(cè)定方法根據(jù)公式

式中:TN-(Total Nitrogen):總氮量,用微量凱氏定氮法測(cè)定[17];AN-(Amino Nitrogen):氨基態(tài)氮的含量,甲醛電位滴定法測(cè)定[18]。

1.3.2氯化血紅素含量的測(cè)定采用分光光度法[6]。

1.4酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1酶解溫度的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細(xì)胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到7.0,分別在溫度40、45、50、55、60 ℃下酶解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測(cè)定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.2酶解時(shí)間的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細(xì)胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到7.0,分別在50 ℃下酶解50、100、150、200、250 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測(cè)定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.3酶解pH的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細(xì)胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測(cè)定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.4酶添加量的選擇將0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細(xì)胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到7.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測(cè)定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以木瓜蛋白酶的酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶添加量作為響應(yīng)子,氯化血紅素的濃度為響應(yīng)值,進(jìn)行Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及編碼水平Table 1　Encode table of factors and levels

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響由圖1分析可知,在一定溫度范圍內(nèi)40～50 ℃,酶解效果與溫度成正相關(guān)。隨著酶解溫度的升高,氯化血紅素濃度與水解度都增大,當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),氯化血紅素濃度達(dá)到8.24 μg/mL,水解度為13.4%,氯化血紅素濃度與水解度都達(dá)到了最高,溫度繼續(xù)提高時(shí)氯化血紅素濃度基本不變,血紅蛋白水解度有所下降,當(dāng)溫度為55 ℃和60 ℃時(shí),氯化血紅素濃度比50 ℃時(shí)下降了3%和4%。由于牦牛血中紅細(xì)胞破胞后血紅蛋白有凝固的趨勢(shì)不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,同時(shí)在酶解過(guò)程中,適當(dāng)?shù)奶岣邷囟瓤稍黾用傅幕盍19],促進(jìn)水解,若溫度過(guò)高,使血紅蛋白和酶變性則對(duì)水解不利,因此選擇50 ℃為木瓜蛋白酶適宜的酶解溫度。

圖1　溫度對(duì)酶解過(guò)程的影響Fig.1　Effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.1.2pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響由圖2得出血紅蛋白經(jīng)過(guò)不同初始的pH處理后,對(duì)氯化血紅素濃度和血紅蛋白的水解度有較大的影響,隨著pH升高氯化血紅素濃度和血紅蛋白的水解度先增大后減小,在pH8.0時(shí)氯化血紅素濃度達(dá)到4.83 μg/mL,水解度也達(dá)到最大,并與其他水平有顯著性差異(p<0.05),當(dāng)pH為8.5和pH9.0時(shí)氯化血紅素濃度比pH8.0時(shí)下降了8%和6%。由于pH作為變性因素的存在,使血紅素上的丙酸基與珠蛋白結(jié)合的兩個(gè)化學(xué)鍵及血紅素中的鐵與珠蛋白組氨酸咪唑環(huán)的氮形成的兩個(gè)配位鍵斷裂[20-22],從而使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分離達(dá)到水解目的,不同的pH處理會(huì)對(duì)底物和酶的構(gòu)象造成較大影響,pH應(yīng)該控制在反應(yīng)最適范圍內(nèi)有利于酶活力的充分發(fā)揮,因此pH在8.0是較優(yōu)選擇。

圖2　pH對(duì)酶解過(guò)程的影響Fig.2　Effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

2.1.3時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響從圖3可以看出氯化血紅素濃度、血紅蛋白水解度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),氯化血紅素濃度、血紅蛋白水解度先增大,在100 min時(shí)氯化血紅素濃度達(dá)到5.97 μg/mL并與其他水平有顯著性差異(p<0.05),血紅素濃度、水解度變小,當(dāng)酶解時(shí)間為150、200、250 min時(shí),氯化血紅素濃度比時(shí)間為100 min時(shí)下降了2%、4%和6%。酶解時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)直接影響整個(gè)反應(yīng),水解時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致反應(yīng)不充分,不能完全水解血紅蛋白釋放出血紅素,水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)作用底物被消耗水解度隨之下降,由于水解產(chǎn)物被氧化以及在體系達(dá)到溶解平衡,致使血紅素濃度和水解度反而減小[23],從原料利用和水解產(chǎn)物等方面考慮酶解時(shí)間取100 min為宜。

圖3　時(shí)間對(duì)酶解過(guò)程的影響Fig.3　Effect of time on the enzymatic hydrolysis process

2.1.4酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響從圖4可以看出,隨著酶量增加,氯化血紅素的濃度與血紅蛋白的水解度量逐漸上升,加酶量0.10 g時(shí)血紅蛋白的水解度最大。當(dāng)酶添加量為0.12、0.14 g時(shí)氯化血紅素濃度相比0.10 g時(shí)降低了2%、3%,之后氯化血紅素濃度基本不變,水解度緩慢減少,說(shuō)明底物已經(jīng)基本被酶飽和了,再增加酶量對(duì)反應(yīng)的貢獻(xiàn)不大,因此選擇酶添加量0.10 g為較優(yōu)值。

圖4　酶添加量對(duì)酶解過(guò)程的影響Fig.4　Effect of add the amount of enzyme on the enzymatic hydrolysis process

2.2響應(yīng)面法確定木瓜蛋白酶水解血紅蛋白的最佳工藝

根據(jù)Box-Behnken的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)原理,參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面分析法對(duì)木瓜蛋白酶水解牦牛血紅蛋白的工藝進(jìn)行分析和優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

血紅素濃度(μg/mL),進(jìn)行回歸分析得到關(guān)于酶解時(shí)間、溫度、pH、酶添加量的四個(gè)因素的擬合二次項(xiàng)多項(xiàng)式方程:

Y=6.51-0.23A-0.12B-0.33C-0.042D-0.040AB-0.11AC+0.032AD+8.419E-003BC-0.068BD-0.054CD-0.42A2-0.45B2-0.66C2-0.57D2

2.2.1牦牛氯化血紅素濃度的響應(yīng)面分析圖5顯示了當(dāng)酶解溫度與酶添加量為中心水平時(shí),酶解時(shí)間與pH對(duì)氯化血紅素濃度的交互作用。酶解時(shí)間一定時(shí),氯化血紅素濃度隨著pH呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);當(dāng)pH不變時(shí),氯化血紅素濃度隨著pH也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);酶解時(shí)間和pH在95～105 min、7.9～8.3之間時(shí),氯化血紅素濃度有最大值。

表2　響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Test design and results of response surface analysis

圖5　酶解時(shí)間、pH對(duì)氯化血紅素濃度的度的響應(yīng)面圖Fig.5　Hydrolysis time and pH on the hemin concentration response surface

圖6顯示了當(dāng)酶解時(shí)間與pH為中心水平時(shí),酶解溫度與酶添加量對(duì)氯化血紅素濃度的交互作用。酶解溫度一定時(shí),氯化血紅素濃度隨著酶添加量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);當(dāng)酶添加量不變時(shí),氯化血紅素濃度隨著酶解溫度也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);酶解溫度和酶添加量在52～56 ℃、0.07～0.09 g之間時(shí),氯化血紅素濃度有最大值。

圖6　酶解溫度、酶添加量 對(duì)氯化血紅素濃度的響應(yīng)面圖Fig.6　Hydrolysis temperature and the amount of enzyme on the hemin of enzyme on the hemin concentration response surface

圖7顯示了當(dāng)酶解時(shí)間與酶解溫度為中心水平時(shí),pH與酶添加量對(duì)氯化血紅素濃度的交互作用。pH一定時(shí),氯化血紅素濃度隨著酶添加量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);當(dāng)酶添加量不變時(shí),氯化血紅素濃度隨著pH也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);pH和酶添加量在7.7～8.1、0.07～0.09 g之間時(shí),氯化血紅素濃度有最大值。

圖7　pH、酶添加量對(duì)氯化血紅素濃度的響應(yīng)面圖Fig.7　Hydrolysis amount of enzyme and pH on the hemin concentration response surface

表3　響應(yīng)面模型的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface model

注:p<0.01 極顯著(**);p<0.05 顯著(*);p>0.05 不顯著(-)。

2.3驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對(duì)氯化血紅素濃度取最大值,由軟件自動(dòng)分析可得到氯化血紅素提取工藝最佳理論值:酶解溫度54.49 ℃、酶解時(shí)間93.80 min、pH7.89、酶添加量0.08 g,血紅素濃度6.59 μg/mL?？紤]實(shí)際操作方便,選取酶解溫度55 ℃,酶解時(shí)間94 min,pH8.0,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),最終氯化血紅素濃度為6.47 μg/mL,與理論值較為接近,說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型的建立對(duì)牦牛血氯化血紅素的獲取具有可行性。

3　結(jié)論

通過(guò)單因素(酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶添加量)四水平為實(shí)驗(yàn)因素,分別以氯化血紅素濃度與血紅蛋白水解度為考察指標(biāo),利用響應(yīng)面軟件對(duì)氯化血紅素含量為響應(yīng)值進(jìn)行模型建立和模型預(yù)測(cè),得出牦牛血中氯化血紅素最佳提取工藝條件分別為:酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。在此工藝條件下,水解度為11.8%,氯化血紅素的濃度可達(dá)6.47 μg/mL,相比理論值減少了1.7%。說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化牦牛血中氯化血紅素提取工藝可行,并為綜合利用牦牛血資源提供了理論依據(jù)。

利用木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素相對(duì)于有機(jī)溶劑法是一種綠色環(huán)保的方法,制備過(guò)程制備時(shí)間短、制備效率高、制備效果好,且獲得的氯化血紅素后期純化過(guò)程簡(jiǎn)單殘留少,在牦牛血液資源開(kāi)發(fā)方面有較大的空間,其具體的應(yīng)用以及后期的開(kāi)發(fā)還需要進(jìn)一步深入探討。

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Study on the preparation technology of hemin from enzymolysis yak blood by papain

JIA Zhi-chun,ZHANG Zhen*,ZHANG Sheng-gui,NIU Li-li,ZHAO Yuan-yuan,XIAO Xue-li,XU Rong-rong,BAO Xue-mei

(College of Food Science and Technology,Gansu Agriculture University,Lanzhou 730070,China)

Preparation hemin with high content hemoglobin in yak blood. With fresh yak blood as the material to get the hemoglobin through pre-treatment,then through enzymolysis to get the hemin. On the basement of single factor test,using combination Box-Benhnken center rotation experiment and response surface analysis,the best extraction process of hemin from hemoglobin by enzymolysis as follows:55 ℃ for enzymolysis temperature,94 min and pH8.0 for enzymolysis,enzyme concentration was 0.08 g. After optimization,the yield of hemin reached 6.47 μg/mL. The enzymolysis yak blood by papain extract hemin is a useful method.

yak blood;papain;hemin;response surface analysis

2015-07-13

賈志春(1990-)，男，碩士，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail: 18894049864@163.com。

張珍(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zhangzhen@gsau.edu.cn。

甘肅省財(cái)政廳高校基本業(yè)務(wù)項(xiàng)目(1011JKCA179)；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(xiàng)(GNSW-2013-22)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)師基金項(xiàng)目；甘肅省自然基金(1107RGZA23)。

TS251.1

B

1002-0306(2016)03-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.035