甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)細(xì)胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄的影響

袁朗月，問(wèn)華肖，魏晨曦，楊　旭

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

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甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)細(xì)胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄的影響

袁朗月，問(wèn)華肖，魏晨曦，楊旭

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

研究了甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)3種細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)轉(zhuǎn)錄水平的影響。將30只雄性BALA/c小鼠隨機(jī)分成5組，設(shè)為空白對(duì)照組、玉米油對(duì)照組、苯染毒組、甲醛染毒組、苯與甲醛聯(lián)合染毒組，每組6只，分別進(jìn)行玉米油溶液、苯溶液灌胃染毒或甲醛氣態(tài)吸入染毒；染毒時(shí)間模擬工廠工作時(shí)間，每天8 h，連續(xù)兩周，第6 d、第7 d休息，第13 d染毒結(jié)束；取小鼠的骨髓和腎臟，提取其總RNA，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，甲醛單獨(dú)作用可使M-CSF、G-CSF、EPO的轉(zhuǎn)錄水平下降；與苯聯(lián)合后，苯加強(qiáng)了甲醛對(duì)M-CSF轉(zhuǎn)錄水平的影響、削弱了甲醛對(duì)G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄水平的影響。

甲醛；苯；M-CSF；G-CSF；EPO；轉(zhuǎn)錄水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

苯和甲醛是人造建筑材料和家居用品中的高危險(xiǎn)性空氣污染物[1]。甲醛來(lái)源廣、毒性大。1987年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)將甲醛歸為可能的人類(lèi)致癌物(在濃度異常高或持續(xù)暴露的情況下)[2]；2006年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將甲醛歸為人類(lèi)致癌物A1組(可引起鼻咽癌，并可能引起白血病)；2009年9月，IARC將甲醛指定為人類(lèi)已知的白血病誘因[3]；2011年，國(guó)家毒理學(xué)項(xiàng)目(NTP)的科學(xué)公告會(huì)議也將甲醛確定為人類(lèi)已知的白血病誘因[4]。許多有關(guān)甲醛與白血病關(guān)系的證據(jù)均來(lái)自流行病學(xué)調(diào)查，但各種流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果的不一致及偶然性使得白血病與甲醛暴露有關(guān)遭到質(zhì)疑，因此需要進(jìn)一步研究甲醛對(duì)白血病的影響機(jī)制[5-7]。

白血病的可能發(fā)病機(jī)制：直接損害骨髓干細(xì)胞。而干細(xì)胞若要發(fā)生癌變，就需要發(fā)生基因突變和基因組的不穩(wěn)定[8]。骨髓位于大骨骼的腔體中，含有造血干細(xì)胞以及多種其它干細(xì)胞。造血是干細(xì)胞增殖、分化及成熟為血細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。諸多因素均可調(diào)控此過(guò)程，最為重要的是細(xì)胞因子(一種可以傳遞細(xì)胞增殖分化信號(hào)的分泌蛋白)的調(diào)控，不僅可以刺激成熟血細(xì)胞行使功能，還可調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖、分化及成熟[9]。作者在此選取3種細(xì)胞因子M-CSF、G-CSF和EPO作為研究對(duì)象，研究甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALA/c小鼠，雄性，體重22 g左右，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2試劑與儀器

甲醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，Sigma公司；苯(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNAiso Plus(總RNA提取試劑)、Oligo(dT)12-18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，寶生物工程(大連)有限公司。

WH-2型智能環(huán)境氣候艙，武漢宇信科技開(kāi)發(fā)公司；4160-2型氣態(tài)甲醛濃度測(cè)定儀，美國(guó)Interscan公司；5415R型低溫冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；ND-1000、CFX96型熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將30只小鼠隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、玉米油對(duì)照組、苯染毒組、甲醛染毒組、苯與甲醛聯(lián)合染毒組，每組6只。每天分別對(duì)5組小鼠進(jìn)行稱重，然后采用仿真式暴露染毒。

具體染毒過(guò)程：

1)空白對(duì)照組：每天在輸入新鮮空氣的玻璃缸內(nèi)待8 h。

2)玉米油對(duì)照組：每天上午，在相同的時(shí)間以濃度為150 mg·kg-1的玉米油進(jìn)行灌胃染毒。

3)苯染毒組：每天上午，在相同的時(shí)間以濃度為150 mg·kg-1的苯溶液進(jìn)行灌胃染毒。

4)甲醛染毒組：每天連續(xù)動(dòng)態(tài)染毒8 h(在玻璃染毒缸中進(jìn)行)，經(jīng)智能環(huán)境氣候艙調(diào)配后，甲醛以濃度為3.0 mg·m-3(我國(guó)2000年前相關(guān)職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的工作場(chǎng)所最高允許濃度)的氣體持續(xù)穩(wěn)定地輸出。艙參數(shù)為：氣體濕度45%，氣溫(23±0.5) ℃，過(guò)艙氣體流量1 L·min-1。

5)苯與甲醛聯(lián)合染毒組：按3)、4)方法進(jìn)行苯與甲醛聯(lián)合染毒。

染毒期間，所有小鼠禁止進(jìn)食和飲水。

1.3.2總RNA的提取

1)骨髓和腎臟的處理：染毒結(jié)束(第13 d)后將小鼠脫頸處死，取出股骨，用注射器吸取1 mL RNAiso Plus，將骨髓沖入EP管中(反復(fù)多次，直至股骨變白)，顛倒混勻10下，22 ℃靜置15 min，待溶液透明后馬上置于冰上，然后可于-70 ℃長(zhǎng)期保存。染毒結(jié)束(第13 d)后將小鼠脫頸處死，取出腎臟，加液氮研成粉末，加1 mL RNAiso Plus覆蓋，液氮溶解后將液體吸入EP管中，顛倒混勻10下，22 ℃靜置15 min，待溶液透明后馬上置于冰上，然后可于-70 ℃長(zhǎng)期保存。

2)提取總RNA：在上述裝有骨髓和腎臟的EP管中加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻10下，劇烈振蕩15 s，22 ℃靜置5 min后于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；將上層水相轉(zhuǎn)入另一EP管中，重復(fù)上述操作；加等體積異丙醇，混勻，在低溫冰上放置10 min，于4 ℃、12 000×g離心10 min；小心棄上清，加預(yù)冷的80%乙醇(用DEPC水配制)1 mL，輕顛倒，于4 ℃、1 000 r·min-1離心5 min；棄上清，EP管口向下在濾紙上盡量吸干管口乙醇；平放EP管，空氣干燥5～10 min，溶于20 μL DEPC水中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，重復(fù)測(cè)定3次。OD260和OD280之間的比值應(yīng)該在1.9～2.0之間。

1.3.3引物設(shè)計(jì)

由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并用NCBI的Primer-Blast檢測(cè)。引物序列如下：

M-CSF：上游TTCCATCCTCACCCTTAGAC，下游TTCTGCTCCTTCTCATCTGTCCTGG；EPO：上游GAATGGAGGTGGAAGAACAGG，下游ACCCGAAGCAGTGAAGTGAG；G-CSF：上游GGGA-AGGAGATGGGTAAAT，下游GCTGCCACTGTT-TCTTTAGGGACTT；β-actin：上游GCATTGTTACCAACTGGGACG，下游TGGCTGGGGTGTTGAAGG。

1.3.4將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

配制20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：取Oligo(dT) 2 μL、總RNA 1 μg，加DEPC水至12 μL，點(diǎn)離，70 ℃變性10 min，立即冰浴5 min，繼續(xù)加入5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP Mixture 1 μL、RRI 0.5 μL、 M-MLV 0.5 μL，加DEPC水至20 μL，42 ℃保溫1 h，75 ℃保溫15 min，然后于4 ℃保存。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用DNA熒光染料SYBR Green I對(duì)M-CSF、G-CSF和EPO進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：上下游引物0.4 μL，模板1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，RNase Free水8.24 μL。模板分別設(shè)有內(nèi)參組和樣品組，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索出3種細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR退火溫度T。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，T溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，熒光檢測(cè)，共39個(gè)循環(huán)。繪制3種細(xì)胞因子的融解曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用2-△△Ct表示，即3種細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量是對(duì)照組的2-△△Ct倍，△△Ct是指實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的△Ct之差，△Ct=Ct樣品組-Ct內(nèi)參組(Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)開(kāi)始指數(shù)擴(kuò)增時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用2-△△Ct進(jìn)行定量分析，用Origin軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用T檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)不同組間數(shù)據(jù)的差異顯著性，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平變化

經(jīng)過(guò)處理后，骨髓細(xì)胞中的M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平變化如圖1所示。

由圖1可知：(1)相對(duì)空白對(duì)照組：苯染毒組M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01)；聯(lián)合染毒組M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01)。(2)相對(duì)聯(lián)合染毒組：苯染毒組M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性(P>0.05)。表明，甲醛單獨(dú)作用可使M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平下降，與苯聯(lián)合后，苯加強(qiáng)了甲醛對(duì)M-CSF轉(zhuǎn)錄水平的影響。

A.空白對(duì)照組　B.玉米油對(duì)照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯(lián)合染毒組　**：與空白組對(duì)照，P<0.01　##：與聯(lián)合組對(duì)照，P<0.01

2.2G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平變化

經(jīng)過(guò)處理后，骨髓細(xì)胞中的G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平變化如圖 2所示。

A.空白對(duì)照組　B.玉米油對(duì)照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯(lián)合染毒組　**：與空白組對(duì)照，P<0.01　##：與聯(lián)合組對(duì)照，P<0.01

由圖 2 可知：(1) 相對(duì)空白對(duì)照組：苯染毒組G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01) ；聯(lián)合染毒組G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上升。(2)相對(duì)聯(lián)合染毒組：苯染毒組G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01)。表明，甲醛單獨(dú)作用可使G-CSF的轉(zhuǎn)錄水平下降，與苯聯(lián)合后，苯削弱了甲醛對(duì)G-CSF轉(zhuǎn)錄水平的影響。

2.3EPO的轉(zhuǎn)錄水平變化

經(jīng)過(guò)處理后，腎臟中EPO的轉(zhuǎn)錄水平變化如圖3所示。

A.空白對(duì)照組　B.玉米油對(duì)照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯(lián)合染毒組　**：與空白組對(duì)照，P<0.01　##：與聯(lián)合組對(duì)照，P<0.01

由圖 3 可知：(1) 相對(duì)空白對(duì)照組：苯染毒組EPO的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組EPO的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01) ；聯(lián)合染毒組EPO的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上升。(2)相對(duì)聯(lián)合染毒組：苯染毒組EPO的轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組EPO的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P<0.01)。表明，甲醛單獨(dú)作用可使EPO的轉(zhuǎn)錄水平下降，與苯聯(lián)合后，苯削弱了甲醛對(duì)EPO轉(zhuǎn)錄水平的影響。

2.4討論

流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均顯示甲醛可導(dǎo)致白血病，尤其是骨髓性的白血病，然而其致病機(jī)理卻不清楚[6]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是甲醛可能引發(fā)損傷的一種機(jī)制[10]，多項(xiàng)研究表明，ROS(尤其是H2O2)的產(chǎn)生在甲醛引起的毒性中扮演重要角色[11-12]。H2O2可打開(kāi)MPTP(線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔)，降低基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的活度，從而減少細(xì)胞凋亡[13-14]。由此可以解釋甲醛單獨(dú)作用時(shí)M-CSF、G-CSF和EPO的轉(zhuǎn)錄水平下降。

Wei等[15]通過(guò)miRNA的表達(dá)譜法研究苯暴露對(duì)小鼠造血作用的影響，將C57BL/6小鼠暴露于濃度為150 mg·kg-1的苯中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯暴露可使小鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少。本研究中，苯的暴露濃度為150 mg·kg-1，因而小鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)量較空白對(duì)照組應(yīng)降低。

G-CSF能刺激骨髓粒細(xì)胞前體，使之分化增殖為成熟粒細(xì)胞的集落[16-17]。EPO主要通過(guò)促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細(xì)胞的生成[18]。本研究中，在苯作用下，G-CSF和EPO的轉(zhuǎn)錄水平上升可能是機(jī)體反饋調(diào)節(jié)的作用所致。

Andrews等[19]研究表明，甲醛作為苯的代謝競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，可以降低苯的代謝和毒性。本研究中，甲醛與苯聯(lián)合作用后，苯削弱了甲醛對(duì)G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄水平的影響，可能是因?yàn)榧兹┦潜降拇x競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。然而對(duì)于M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平變化，甲醛與苯聯(lián)合作用后，苯卻加強(qiáng)了甲醛對(duì)M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平的影響。這可能是因?yàn)?，苯具有高揮發(fā)性，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)因揮發(fā)使其濃度降低，Wetmore等[20]研究表明，在低濃度時(shí)，苯可以加強(qiáng)甲醛對(duì)小鼠的代謝和基因毒性，這也是本研究中苯可以加強(qiáng)甲醛對(duì)M-CSF轉(zhuǎn)錄水平的影響的原因。

3　結(jié)論

研究了甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)等3種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果表明，甲醛單獨(dú)作用可使M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平下降；與苯聯(lián)合后，苯加強(qiáng)了甲醛對(duì)M-CSF轉(zhuǎn)錄水平的影響、削弱了甲醛對(duì)G-CSF和EPO的轉(zhuǎn)錄水平的影響。

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Effect of Formaldehyde on Transcription of Cytokine M-CSF,G-CSF and EPO in the Presence and Absence of Benzene

YUAN Lang-yue,WEN Hua-xiao,WEI Chen-xi,YANG Xu

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeSciences,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Effectsofformaldehydeonthetranscriptionlevelofmacrophagecolonystimulatingfactor(M-CSF),granulocytecolonystimulatingfactor(G-CSF)anderythropoietin(EPO)inthepresenceandabsenceofbenzenewereinvestigated.ThirtyBALA/cmalemicewererandomlydividedinto5groups(6foreachgroup):blankcontrolgroup,cornoilcontrolgroup,benzeneexposuregroup,formaldehydeexposuregroup,benzeneassociatedwithformaldehydeexposuregroup.Andthemicewereexposedbyintragastricadministrationofcornoilsolutionorbenzenesolution,formaldehydegassuction,respectively.Exposuretimewassimulatedfactoryworkschedule,8hadayfortwoweeks,withanexposure-free“weekend”ondays6and7,sacrificedonday13.ThebonemarrowandkidneywerepreparedtoextracttotalRNA,thenreal-timefluorescencequantitativePCRtechniquewasappliedtotestthechangeoftranscriptionlevelforcytokineM-CSF,G-CSFandEPO.Resultsshowedthat,formaldehydealonecoulddecreasethetranscriptionlevelofM-CSF,G-CSFandEPO,whenformaldehydeassociatedwithbenzene,benzenecouldenhancetheinfluenceofformaldehydeontranscriptionlevelofM-CSF,weakentheinfluenceofformaldehydeontranscriptionlevelofG-CSFandEPO.

formaldehyde;benzene;M-CSF;G-CSF;EPO;transcriptionlevel;real-timefluorescencequantitativePCR

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51136002)

2016-03-27

袁朗月(1989-)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：分子毒理學(xué)，E-mail：1048896082@qq.com；通訊作者：楊旭，教授，E-mail：yangxu@mail.ccnu.edu.cn。

R 994.6R 318

A

1672-5425(2016)08-0031-04

袁朗月，問(wèn)華肖，魏晨曦，等.甲醛在有無(wú)苯作用下對(duì)細(xì)胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉(zhuǎn)錄的影響[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：31-34，38.