王紅梅，孫啟忠，屠焰，司丙文，薩如拉，那亞，刁其玉*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

?

呼倫貝爾草原野生牧草青貯中優(yōu)良乳酸菌的分離及鑒定

王紅梅1，孫啟忠2，屠焰1，司丙文1，薩如拉2，那亞3，刁其玉1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

本研究對(duì)呼倫貝爾草原牧草青貯飼料中的乳酸菌進(jìn)行了分離、鑒定，旨為篩選出優(yōu)良乳酸菌菌株。以4個(gè)地區(qū)不同群落牧草的青貯飼料為試驗(yàn)材料，并采用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法及16S rRNA序列分析對(duì)分離得到的乳酸菌菌株進(jìn)行了鑒定。菌株DME53為草乳桿菌，DMG108為干酪乳桿菌，DMC80為植物乳桿菌，DMG138為短乳桿菌，DMG139為戊糖片球菌；其中菌株DMG138為異型發(fā)酵乳酸菌，其余4株菌均為同型發(fā)酵乳酸菌。除DMG139在40和45 ℃下生長(zhǎng)微弱外，其余菌株均在5～45 ℃不同溫度條件下, 3.0%和6.5% NaCl培養(yǎng)液中良好生長(zhǎng)。除菌株DME53在pH 3.0下不能生長(zhǎng)外，其余菌株均在pH 3.0～8.0條件下良好生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)。菌株DMC80具有產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、發(fā)酵速率較快、耐酸、耐低溫等特性，可作為制備適用于呼倫貝爾地區(qū)青貯飼料菌制劑的優(yōu)良菌株。

乳酸菌；植物乳桿菌；青貯飼料；牧草；呼倫貝爾草原

呼倫貝爾草原是我國(guó)草原的重要組成部分之一，也是我國(guó)迄今植被保存較好，生物多樣性豐富，區(qū)位優(yōu)勢(shì)顯著，緯度最高，位置最北的一片天然草原[1]。其年溫度差較大，冬季寒冷干燥，夏季炎熱多雨，嚴(yán)重導(dǎo)致季節(jié)性飼草營(yíng)養(yǎng)不平衡，雨季制作干草也比較困難，造成了“夏肥、秋壯，冬瘦、春死”的惡性循環(huán)。通過(guò)青貯技術(shù)可將牧區(qū)夏季富余的牧草或半農(nóng)半牧區(qū)牧草及農(nóng)作物秸稈調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青綠飼料，不僅保存了原料營(yíng)養(yǎng)成分，還能夠達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，有效解決飼草料供應(yīng)的季節(jié)性制約問(wèn)題[2]。

乳酸菌在青貯過(guò)程中起到舉足輕重的作用，其數(shù)量、種類(lèi)及活性是影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)乳酸菌在青貯飼料中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，主要包括優(yōu)良乳酸菌的分離篩選[3]，其對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[4-5]和有氧穩(wěn)定性的影響[6-7]以及青貯飼料添加乳酸菌在奶牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用等[8]。而青貯原料來(lái)源對(duì)青貯飼料乳酸菌特性具有很大的影響，如不同原料青貯飼料中所分布的乳酸菌數(shù)量及種類(lèi)均存在有一定的差異[9-10]，還有同種原料不同環(huán)境溫度條件或不同季節(jié)青貯飼料中所分離得到的乳酸菌也存在不同程度的差異[11-12]。目前青貯飼料研究原料來(lái)源較多，但針對(duì)天然牧草，尤其是對(duì)我國(guó)北方高寒地區(qū)天然牧草特有的乳酸菌種質(zhì)資源研究還很薄弱，發(fā)揮其適應(yīng)性的特性，為提高青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性，分離篩選青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌尤為重要。因此，本研究以呼倫貝爾草原天然牧草為原料，進(jìn)行青貯發(fā)酵分離其乳酸菌，并對(duì)其表型特征、生理生化特性及16S rRNA進(jìn)行分類(lèi)鑒定，旨在篩選出優(yōu)良乳酸菌菌株，為制備優(yōu)質(zhì)青貯飼料專(zhuān)用乳酸菌添加劑的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2011年8月初采自呼倫貝爾草原地區(qū)5個(gè)站點(diǎn)的牧草(表1)，刈割后將牧草切短至2～3 cm，裝入聚乙烯袋，每袋重量200～300 g[9]，每個(gè)樣品取3袋，然后用真空包裝機(jī)抽真空并封口在室溫條件下貯藏。青貯60 d后對(duì)各試驗(yàn)樣品分別進(jìn)行乳酸菌的分離與鑒定。

1.2培養(yǎng)基、試劑及儀器設(shè)備

MRS培養(yǎng)基購(gòu)自Difco Laboratories(底特律，美國(guó))。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，PCR合成引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、Olympus BX5.1光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌鍋、磁力攪拌器、PCR儀、凝膠成像電泳儀、超低溫冰箱、pH計(jì)(雷磁PHSJ-5)、紫外可見(jiàn)雙束分光光度計(jì)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌的分離、純化與保存在超凈工作臺(tái)中取待測(cè)青貯樣品5 g，剪碎并混勻，放入裝有45 mL無(wú)菌水的三角瓶，封口膜密封，置于搖床上振蕩30 min，使乳酸菌細(xì)胞分散，靜置30 s，配制成10-1,10-3和10-5稀釋液。然后分別取20 μL菌液滴在MRS培養(yǎng)基上面用涂布棒涂抹均勻，將涂抹好的培養(yǎng)基靜置20～30 min，使菌液滲透至培養(yǎng)基內(nèi)，然后將其倒轉(zhuǎn)，在37 ℃厭氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，并挑取典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢。

凡是革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)呈陰性的菌株初步確定為乳酸菌，并采用平板劃線法繼續(xù)純化2次后將菌株在Nutrient broth培養(yǎng)基(加入10%的二甲基亞砜)中，-80 ℃低溫冰箱保存，備用。

1.3.2乳酸菌的鑒定1)表型特征鑒定：乳酸菌革蘭氏染色法、生理生化試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、不同梯度溫度生長(zhǎng)試驗(yàn)和耐鹽試驗(yàn)均參考文獻(xiàn)[13]中方法進(jìn)行。

產(chǎn)氣試驗(yàn)：將杜氏小管(排凈空氣)倒置于裝有MRS液體培養(yǎng)基，滅菌后接種乳酸菌，培養(yǎng)2 d，觀察杜氏小管內(nèi)是否有氣體出現(xiàn)，不產(chǎn)氣體為同型發(fā)酵乳酸菌，產(chǎn)氣體則為異型發(fā)酵乳酸菌。

表1　青貯材料及來(lái)源

耐酸試驗(yàn)：將培養(yǎng)好的乳酸菌單菌落轉(zhuǎn)接到pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0等不同酸度MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后取出來(lái)觀察并記錄乳酸菌的生長(zhǎng)情況。

2)乳酸菌菌株16S rRNA序列的分子標(biāo)記：取30 ℃條件下培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)液各1 mL，13000 r/min離心10 min，沉淀物用于DNA提取，菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增引物：27f(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)和1492r(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：2×Taq PCR Master Mix為25 μL，20 pm的兩種引物各2 μL，乳酸菌DNA模板3 μL，雙蒸水為18 μL；擴(kuò)增片段約為1500 bp；PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性98 ℃ 50 s，退火55 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。制備1.5%瓊脂糖凝膠，0.5×TAE 緩沖液，用無(wú)菌槍頭吸取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與3 μL 6×Loading Buffer混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，電壓為5 V/cm，電泳30 min。電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠用溴化乙錠染色25 min，再放入凝膠成像儀下觀察。PCR純化產(chǎn)物送樣進(jìn)行雙向測(cè)序(上海桑尼生物科技有限公司)。

利用BLAST待測(cè)菌株16S rRNA堿基序列與將GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，選出與目的基因序列同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種，并從GenBank中提取已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列與待測(cè)菌株的16S rRNA序列一同帶入MEGA 4軟件中，利用CLUSTAL W進(jìn)行多重比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]。

1.4優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選與確定

1.4.1乳酸菌產(chǎn)酸速率測(cè)定將分離并鑒定的乳酸菌菌株分別按3%的接種量接入無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h。從0 h開(kāi)始到24 h每隔2 h及最后48 h測(cè)定菌株發(fā)酵液的pH值，根據(jù)每株乳酸菌從開(kāi)始至12 h的7個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液pH值繪制出產(chǎn)酸速率曲線圖。

1.4.2生長(zhǎng)曲線的制作將乳酸菌菌株24 h的發(fā)酵液，接種量為3%，接種于無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h。從開(kāi)始每隔2 h取1次樣品，以無(wú)菌MRS培養(yǎng)基為空白，在波長(zhǎng)為620 nm下測(cè)定樣品的吸光度值(OD值)，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為OD值，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和曲線圖制作，并用MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1分離乳酸菌菌株生理生化鑒定

本試驗(yàn)從呼倫貝爾草原天然牧草青貯飼料中分離出的5株乳酸菌菌株DME53、DMG108、DMC80、DMG138和DMG139(表2)。分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表3所示，5菌株均為革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性菌，能夠在NaCl濃度為 3.0%和6.5%，溫度為5和10 ℃，pH為4.5，5.0和7.5等環(huán)境條件下生長(zhǎng)。其中，菌株DMG139為球菌，其余4菌株均為桿菌；DMG138發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣體，屬于異型發(fā)酵乳酸菌，而其余菌株發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣體，均屬于同型發(fā)酵乳酸菌。除菌株DMG139在40和45 ℃條件下弱生長(zhǎng)，其余菌株均能夠良好生長(zhǎng)。在pH 3.0條件下，菌株DME53不能生長(zhǎng)，其他4菌株均弱生長(zhǎng)；在pH 3.5條件下，5菌株均弱生長(zhǎng)；在pH 4.0條件下，只有DMC80良好生長(zhǎng)，其余菌株均弱生長(zhǎng)；當(dāng)pH 8.0時(shí)，除DMG138，其余菌株均能夠良好生長(zhǎng)。

表2　牧草青貯飼料中分離的乳酸菌菌株

表3　青貯飼料中乳酸菌菌株的特性

注：“+”表示能良好生長(zhǎng)，“-”表示不能生長(zhǎng)，“W”表示弱生長(zhǎng)。

Note: “+” means positive, “-” means negative, “W” means weakly positive.

2.2分離菌株16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

5株乳酸菌菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增序列長(zhǎng)度分別大于1460 bp，在GenBank中進(jìn)行16S rRNA基因同源性序列比對(duì)，經(jīng)BLAST比較鑒定，與標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌菌株序列相似性均達(dá)到了99%以上。如圖1所示，5株乳酸菌菌株聚類(lèi)為2屬，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)，其中菌株DMC80為植物乳桿菌(L.plantarum)、DME53為草乳桿菌(L.graminis)、DMG108為干酪乳桿菌(L.casei)、DMG138為短乳桿菌(L.brevis)、DMG139為戊糖片球菌(P.pentosaceus)。表4中列出用于MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的5種乳酸菌參考菌株。

圖1　基于16S rRNA基因序列建立的乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of five LAB strains

2.3 乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力比較

5株乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力比較分析結(jié)果見(jiàn)圖2,表現(xiàn)出相似的產(chǎn)酸速率。5菌株在0～4h產(chǎn)酸速率較快,4～6h逐漸變緩,8～12h基本趨于平穩(wěn)。菌株DMC80、DME53、DMG108、DMG138和DMG139發(fā)酵12h之后的pH值分別為3.93,4.49,4.28,4.34和4.38。DMC80的產(chǎn)酸速率最快,與其余4菌株存在顯著差異(P<0.05),其次為菌株DMG108。也就是說(shuō),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),菌株DMC80的pH值始終處于最低水平,產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。

2.4 乳酸菌菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

表4　用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的乳酸菌參考菌株

由圖3可知,5株乳酸菌均在2～4h時(shí)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4～10 h時(shí)生長(zhǎng)速度達(dá)到最大，10～12 h時(shí)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，之后pH值和OD值變化較小，但均稍有增加的趨勢(shì)，在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的衰退期。5株乳酸菌DMC80、DME53、DMG108、DMG138和DMG139發(fā)酵36 h的OD值分別為3.41，2.77，3.27，2.79和2.69。菌株DMC80的生長(zhǎng)速度最快。說(shuō)明5株菌在MRS液體培養(yǎng)基中0～10 h的代謝活動(dòng)較快，能使細(xì)胞迅速分裂增長(zhǎng)，促進(jìn)乳酸的生成，使pH值快速降低，進(jìn)入穩(wěn)定期保持不變，進(jìn)而在青貯發(fā)酵進(jìn)程中抑制有害菌的生長(zhǎng)。

3　討論

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)不同原料青貯飼料乳酸菌分類(lèi)鑒定的相關(guān)報(bào)道較多，主要分類(lèi)為乳桿菌、片球菌、明串珠菌、腸球菌、乳球菌、鏈球菌以及魏斯特氏菌7個(gè)屬[3-4,15]。不同原料來(lái)源，具有不同的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致青貯過(guò)程中微生物尤其是乳酸菌的多樣性。乳酸菌在飼草青貯發(fā)酵過(guò)程中起著重要的作用，其種類(lèi)、數(shù)量和活性是抑制不良微生物生長(zhǎng)和減少營(yíng)養(yǎng)損失的一個(gè)重要因素，發(fā)酵品質(zhì)取決于青貯原料表面附生乳酸菌數(shù)量和底物含量[16-17]。

圖2　乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率曲線Fig.2　Rate of lactic acid production in LAB

圖3　乳酸菌菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3　Growth curve of LAB

自然界中，植物表面附生乳酸菌的數(shù)量較少，一般達(dá)不到良好發(fā)酵所需的最低水平105cfu/g FM[18]，而且以異型發(fā)酵乳酸菌為主，在青貯過(guò)程中很難成為優(yōu)勢(shì)菌群，難以保證青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。因此，分離青貯飼料中生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、抗逆性較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)乳酸菌顯得尤為重要。本試驗(yàn)中，從呼倫貝爾草原牧草青貯飼料中分離獲得5株乳酸菌菌株，經(jīng)傳統(tǒng)鑒定方法及16S rRNA序列分析，菌株DMC80為植物乳桿菌，DME53為草乳桿菌，DMG108為干酪乳桿菌，DMG138為短乳桿菌，DMG139為戊糖片球菌。

在自然青貯發(fā)酵過(guò)程中，環(huán)境溫度是影響乳酸菌活性的重要因素之一[11]。Cao等[12]對(duì)不同季節(jié)的TMR青貯進(jìn)行研究結(jié)果表明，冬季的低溫條件限制乳酸菌活性的發(fā)揮。呼倫貝爾草原位于我國(guó)東北部，年平均溫度0 ℃左右，無(wú)霜期85～155 d，具有氣溫低，晝夜溫差大等氣候特點(diǎn)，可能會(huì)限制商品乳酸菌菌劑的生長(zhǎng)及活性的發(fā)揮。Liu等[19]研究報(bào)道，在20 ℃條件下，商品乳酸菌的活性會(huì)受到影響，不能很好地發(fā)揮作用。而本研究中所分離到的5株乳酸菌均能夠在5 ℃條件下生長(zhǎng)旺盛，具有較強(qiáng)的耐低溫特性，體現(xiàn)了分離到的乳酸菌對(duì)高寒環(huán)境的適應(yīng)性。

產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)，同時(shí)也是體現(xiàn)乳酸菌活性的重要特征，不同菌株間存在一定程度的差異。McDonald等[16]指出作為理想的青貯用乳酸菌添加劑必備的條件是：1)生長(zhǎng)旺盛，迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群，抑制有害微生物的活性；2)同型發(fā)酵乳酸菌，迅速增加乳酸的生成濃度及速率，使pH值迅速降至4.0左右；3)耐酸能力強(qiáng)，在低pH環(huán)境下能很好地生長(zhǎng)或保持其活性；4)可利用多種單糖和多糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果膠糖，尤其是戊糖等。后來(lái)有大量研究證明，異型發(fā)酵乳酸菌能夠提高有氧穩(wěn)定性，防止二次發(fā)酵。當(dāng)青貯飼料暴露于空氣中時(shí)，同型發(fā)酵乳酸菌植物乳桿菌能產(chǎn)生大量乳酸，但產(chǎn)生的抑制酵母菌和霉菌生長(zhǎng)的短鏈脂肪酸卻很少[20]，由于產(chǎn)生的乳酸為乳酸同化型酵母菌提供了底物，從而引起飼料的腐敗和霉變。而異型發(fā)酵乳酸菌如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)則提高乙酸的產(chǎn)生量，抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，從而提高了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性的改善[21]。本試驗(yàn)所分離到的5株乳酸菌中，菌株DMC80發(fā)酵12 h后的pH值最低(3.93)，發(fā)酵36 h的OD值最高(3.41)，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵速度最快的植物乳桿菌；也具有較強(qiáng)的耐酸特性，能夠在pH 3.0～3.5條件下生長(zhǎng)，pH 4.0時(shí)生長(zhǎng)旺盛，具備了理想的青貯添加劑菌種的條件。

大多數(shù)青貯飼料接種菌中均包含植物乳桿菌，通常與其他的乳酸菌混合使用。植物乳桿菌作為同型發(fā)酵乳酸菌接種劑，能夠產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，從而提高青貯飼料的品質(zhì)。但它也有其局限性，如在厭氧條件下，pH 5.0以上時(shí)，植物乳桿菌一般很難生長(zhǎng)，因此一般選用更適合青貯發(fā)酵初始條件的菌種如屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)和戊糖片球菌[22]，也有與效果較好的異型發(fā)酵乳酸菌布氏乳桿菌混合使用，以便提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性，防止二次發(fā)酵[7]；也有與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)搭配使用，能夠產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，將多糖降解成二糖或單糖，為乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖提供更多的發(fā)酵底物[23]?，F(xiàn)也有在青貯飼料中使用復(fù)合酶菌制劑，針對(duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高的原料，使用酶制劑將青貯原料中纖維素、半纖維素降解為水溶性碳水化合物，提高糖分質(zhì)量，為乳酸菌提供更多的發(fā)酵碳源[24]，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，從而乳酸菌和酶混合制劑可進(jìn)一步提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[25]。

本試驗(yàn)分離得到的植物乳桿菌DMC80為制備優(yōu)良青貯菌劑提供了可能，對(duì)于能否可作為呼倫貝爾地區(qū)青貯飼料添加劑菌種以及其添加水平，還需有待進(jìn)一步證實(shí)。

4　結(jié)論

本研究從呼倫貝爾草原牧草青貯飼料中分離得到5株乳酸菌菌株，經(jīng)過(guò)經(jīng)典鑒定方法和16S rRNA序列分析歸類(lèi)為2屬5種，分別為乳桿菌屬和片球菌屬的植物乳桿菌，戊糖片球菌，短乳桿菌，干酪乳桿菌和草乳桿菌，其中植物乳桿菌DMC80產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵速度最快，耐酸和耐低溫能力較強(qiáng)，適宜用作呼倫貝爾地區(qū)青貯飼料乳酸菌添加劑的菌種。

References：

[1]Hong F C. China Pratacultural History[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2011.

[2]Yu Z, Jia Y S. Forage Processing and Storage[M]. Beijing: China Agricultural University Press, 2010.

[3]Cai Y M. Identification and characterization of enterococcus species isolated from forage crops and their influence on silage fermentation. Journal of Dairy Science, 1999, 82: 2466-2471.

[4]Cai Y, Benno Y, Ogawa M,etal. Influence ofLactobacillusspp. from an inoculant and ofWeissellaandLeuconostocspp. from forage crops on silage fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64: 2982-2987.

[5]Wang K K, Yu Z, Shao T,etal. Effects oflactobacilluson fermentation quality of mixed silage ofMedicagosativaandElymusdahuricus. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(4): 94-100.

[6]Daniel J L P, Checolli M, Zwielehner J,etal. The effects ofLactobacilluskefiriandL.brevison the fermentation and aerobic stability of sugarcane silage. Animal Feed Science and Technology, 2015, 205: 69-74.

[7]Hong M, Diao Q Y, Jiang C G,etal. Review for effect ofLactobacillusbuchnerion the silage. Acta Prataculturae Sinica,2011, 20(5): 266-271.

[8]Weinberg Z G, Ashbell G, Chen Y. Stabilization of returned dairy products by ensiling with straw and molasses for animal feeding. Journal of Dairy Science, 2003, 86: 1325-1329.

[9]Zhang H J. The Dynamic Changes of Microbial Flora in Forage Silage and Identification and Screening of Lactic Acid Bacteria Species Isolated from Forage Silage[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011.

[10]Wang L, Sun Q Z, Zhang H J. A study on quality of mixed silage of alfalfa and corn. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(4): 202-209.

[11]Weinberg Z G, Szakacs G, Ashbell G,etal. The effect of temperature on the ensiling process of corn and wheat. Journal of Applied Microbiology, 2001, 90(4): 561-566.

[12]Cao Y, Cai Y, Hirakubo T,etal. Fermentation characteristics and microorganism composition of total mixed ration silage with local food by-products in different seasons. Animal Science Journal, 2011, 82(2): 259-266.

[13]Dong X Z, Cai M Y. Common Bacterial Identification Manual[M]. Beijing: Science Press, 2001.

[14]Woo P C, Chong K T, Leung K,etal. Identification ofArcobactercryaerophilusisolated from a traffic accident victim with bacteremia by 16s ribosomal RNA gene sequencing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2001, 40(3): 125-127.

[15]Pahlow G, Muck R E, Driehuis F,etal. Microbiology of ensiling[C]// Buxton D R, Muck R E, Harrison J H. Silage Science and Technology. Madison: American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America, 2003: 38-41.

[16]McDonald P, Henderson A R, Heron S J. The Biochemistry of Silage[M]. 2nd ed. Aberystwyth: Cambrian Printers Ltd, 1991.

[17]Yang X D, Yuan X J, Guo G,etal. Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 99-107.

[18]Tengerdy R P, Welnberg Z G, Szakacs G,etal. Ensiling alfalfa with additives of lactic acid bacteria and enzymes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1991, 55(2): 215-228.

[19]Liu Q H, Chen M, Zhang J,etal. Characteristics of isolated lactic acid bacteria and their effectiveness to improve stylo (StylosanthesguianensisSw.) silage quality at various temperatures. Animal Science Journal, 2012, 83(2): 128-135.

[20]Wohlt J E. Use of silage inoculant to improve feeding stability and intake of a corn silage-grain diet. Journal Dairy Science, 1989, 72(2): 545-551.

[21]Danner H, Holzer M, Mayrhuber E,etal. Acetic acid increases stability of silage under aerobic conditions. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 562-567.

[22]Cai Y, Yumai S, Ogawa M,etal. Characterization and identification ofPediococcusspecies isolated from forage crops and their application for silage preparation. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65: 2901-2906.

[23]Keles G, O’Kiely P, Forristal P D. A note on the conservation characteristics of baled grass silages ensiled with different additives. Irish Journal of Agricultural and Food Research, 2010, 49(1): 81-86.

[24]Zhang J X, Qiao H X, Liu Y T. Effects of moisture and additives on feed quality of alfalfa silage. Pratacultural Science, 2014, 31(4): 766-770.

[25]Zhao M M, Yu Z. Effects of lactic acid bacteria and cellulase onNapiergrass silages. Acta Agrestia Sinica, 2015, 23(1): 205-210.

[1]洪紱曾. 中國(guó)草業(yè)史[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[2]玉柱, 賈玉山. 牧草飼料加工與貯藏[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2010.

[5]王昆昆, 玉柱, 邵濤, 等. 乳酸菌制劑對(duì)不同比例苜蓿和披堿草混貯發(fā)酵品質(zhì)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(4): 94-100.

[7]洪梅, 刁其玉, 姜成鋼, 等. 布氏乳桿菌對(duì)青貯發(fā)酵及其效果的研究進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 266-271.

[9]張慧杰. 飼草青貯微生物菌群動(dòng)態(tài)變化與乳酸菌的鑒定篩選[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

[10]王林, 孫啟忠, 張慧杰. 苜蓿與玉米混貯質(zhì)量研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(4): 202-209.

[13]東秀株, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[17]楊曉丹, 原現(xiàn)軍, 郭剛, 等. 西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優(yōu)良乳酸菌的篩選. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(6): 99-107.

[24]張金霞, 喬紅霞, 劉雨田. 水分和添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響. 草業(yè)科學(xué), 2014, 31(4): 766-770.

[25]趙苗苗, 玉柱. 添加乳酸菌及纖維素酶對(duì)象草青貯品質(zhì)的改善效果. 草地學(xué)報(bào), 2015, 23(1): 205-210.

Isolation and identification of high-quality lactic acid bacteria from wild forage silages on the Hulunbuir prairie

WANG Hong-Mei1, SUN Qi-Zhong2, TU Yan1, SI Bing-Wen1, SA Ru-La2, NA Ya3, DIAO Qi-Yu1*

1.FeedResearchInstitute,KeyLaboratoryofFeedBiotechnology,theMinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China; 3.CollegeofEcologyandEnvironmentalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010011,China

The objectives of this study were to identify lactic acid bacteria (LAB) from forage silages on the Hulunbuir prairie and screen LAB for desirable attributes. LAB strains were isolated from grass silages of four different communities and identified with classical identification and 16S rRNA analysis methods. Five strains: DME53, DMG108, DMC80, DMG138 and DMG139 were isolated and identified asLactobacillusgraminis,L.casei,L.plantarum,L.brevisandPediococcuspentosaceus, respectively, in which DMG138 was identified as heterofermentative LAB while the other four strains were all homofermentative LAB. All five strains grew well at different temperatures, ranging from 5 to 45 ℃, and in 3.0% and 6.5% NaCl; an exception was that DMG139 grew poorly at 40 and 45 ℃. All strains generally grew well at pH ranging from 3.0-8.0; however, DME53 was inactive at pH 3.0. In conclusion, strain DMC80 demonstrated consistently desirable traits; strong acid production capacity, rapid fermentation rate and good tolerance of acidity and cold which could be used for the preparation of silage in Hulunbuir prairie.

lactic acid bacteria;Lactobacillusplantarum; silage; forage; Hulunbuir prairie

10.11686/cyxb2016092http://cyxb.lzu.edu.cn

王紅梅, 孫啟忠, 屠焰, 司丙文, 薩如拉, 那亞, 刁其玉. 呼倫貝爾草原野生牧草青貯中優(yōu)良乳酸菌的分離及鑒定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(8): 189-196.

WANG Hong-Mei, SUN Qi-Zhong, TU Yan, SI Bing-Wen, SA Ru-La, NA Ya, DIAO Qi-Yu. Isolation and identification of high-quality lactic acid bacteria from wild forage silages on the Hulunbuir prairie. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 189-196.

2016-03-01；改回日期：2016-04-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專(zhuān)項(xiàng)(20120304202)和內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專(zhuān)項(xiàng)資助。

王紅梅(1983-)，女，內(nèi)蒙古通遼人，博士后。E-mail: chasu927@163.com

Corresponding author. E-mail: diaoqiyu@caas.cn