潘現(xiàn)飛 施泉 林新春 徐英武 曹友志

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300）

利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選雷竹SOC1相互作用蛋白

潘現(xiàn)飛 施泉 林新春 徐英武 曹友志

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300）

在雷竹（Phyllostachys violascens）中找到SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSl（SOCl）在開花途徑中的作用靶標，進一步探索SOCl的作用機制。構(gòu)建pGBKT7-PvSOC1誘餌表達載體，通過SMART技術(shù)構(gòu)建開花時期的雷竹cDNA文庫，酵母雙雜交篩選與SOC1互作的蛋白，并對其進行分析鑒定。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了可用于酵母雙雜交的cDNA文庫，文庫的轉(zhuǎn)化率為每微克pGADT7-Rec 3.0×106轉(zhuǎn)化子，文庫滴度為7.5×106cfu/mL，插入片段主要在250-2 000 bp之間。通過酵母雙雜交實驗得到與誘餌蛋白PvSOC1相互作用的蛋白，篩選到的靶標蛋白經(jīng)鑒定是一個富含亮氨酸的蛋白激酶，特征氨基酸序列在不同物種中非常保守，與水稻中的同源蛋白親緣性最高。

雷竹；SOC1；cDNA文庫；酵母雙雜交；蛋白質(zhì)互作

開花是高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志［1］，MADS-box基因家族編碼一類轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物開花時間和花形態(tài)形成中發(fā)揮重要作用［2］，而SOCl是MADS-box基因家族的一員，能夠介導來自光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑的花時基因信號［3］，作用于下游花分生組織特異基因，促進植物開花，是參與植物開花的一個重要基因，對SOC1蛋白及與其相互作用蛋白的研究對探究植物開花有很大幫助。

雷竹（Phyllostachys violascens）為禾本科竹亞科剛竹屬竹種，是中國特有的優(yōu)良經(jīng)濟竹種。雷竹開花現(xiàn)象十分普遍［4］，觀察結(jié)果顯示，雷竹開花時間不規(guī)律，開花前具有一些明顯的預兆，表現(xiàn)為雷竹筍出土時間提早，產(chǎn)量低，個體比正常筍較小，顏色偏紅。多數(shù)雷竹開花后不久便死亡，造成竹林的整體衰敗?，F(xiàn)階段，對雷竹開花調(diào)控機理方面的研究報道還比較少。本課題組目前已獲得雷竹SOCl的編碼序列，以此為基礎(chǔ)進行相關(guān)實驗，相信可以更好地幫助了解雷竹開花的分子調(diào)控機制。

分子生物學中，若想特異性反映某種組織或細胞在特定發(fā)育階段表達的編碼基因，構(gòu)建cDNA文庫具有明顯的優(yōu)勢。同時，酵母雙雜交（yeast two hybrid，Y2H）是一種快速檢測和鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法［5］，其原理是通過激活報告基因的表達來研究蛋白質(zhì)的相互作用［6］，利用已知蛋白質(zhì)通過雙雜交技術(shù)從酵母cDNA文庫中篩選與之相互作用的靶標蛋白，對實驗研究有很大的幫助［7，8］，該技術(shù)已經(jīng)在擬南芥、水稻等許多植物研究中得到廣泛應(yīng)用［9，10］。本實驗通過構(gòu)建開花時期雷竹的酵母雙雜交cDNA文庫，并利用花期調(diào)控蛋白SOC1作為誘餌，篩選參與調(diào)控雷竹開花的蛋白，以期為研究SOC1的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 材料來源為浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學校園竹種園內(nèi)3-4月份開花時期的雷竹，每隔一周分別采取嫩葉、成熟葉、竹莖、花芽和花，液氮速凍后保存到-80℃超低溫冰箱。

1.1.2實驗試劑 克隆載體T-Vector pMD19（simple）購自TaKaRa公司，誘餌表達載體pGBKT7、pGADT7、酵母菌株AH109/Y187購自Clontech公司。酵母雙雜交試劑盒BD Matchmaker Library Construction ＆amp; Screening Kits、Aureobasidin A（AbA）、酵母培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化試劑購自Clontech公司。酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化公司，構(gòu)建重組載體所用各種酶、DNA Marker、膠回收純化試劑盒、LB培養(yǎng)基組分胰蛋白胨和酵母膏購自TaKaRa公司，引物合成和測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2方法

1.2.1誘餌表達載體構(gòu)建 根據(jù)雷竹SOCl編碼序列設(shè)計引物對其CDS區(qū)進行PCR擴增，上游引物：5'-CGGAATTCATGGTGCGGGGGAAGACGCA-3'，下游引物：5'-GCGTCGACTCAAGCATGGTTAGCCCGAT-3'，產(chǎn)物連接到T-Vector pMD19（simple）克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆菌液送上海生工生物工程公司測序，將測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒。將陽性克隆質(zhì)粒與pGBKT7載體同時進行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物回收，T4 DNA連接酶連接5 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，單克隆菌斑進行PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子并進行質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.2誘餌蛋白毒性及自激活檢測 將空載體pGBKT7質(zhì)粒（對照）和重組質(zhì)粒pGBKT7-PvSOC1分別轉(zhuǎn)入酵母AH109感受態(tài)細胞分別涂布于SD/-Trp和 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上，30℃孵育2-3 d，觀察菌落形態(tài)及其顏色，以此判斷是否具有自激活活性。

1.2.3cDNA文庫的建立 將采集的雷竹不同部位樣品混合，在液氮中快速研磨成粉狀，采用Trizol法提取總RNA。用Oligo（dT）Primer合成第一條單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模板進行LD-PCR合成雙鏈cDNA，采用SPINTMTE-400柱子純化雙鏈cDNA，回收大于500 bp 雙鏈DNA，利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的雙鏈cDNA。cDNA文庫構(gòu)建的具體步驟參照崔紅軍等［11］說明的文庫構(gòu)建方法進行，采用醋酸鋰方法制備完酵母感受態(tài)細胞，在10 mL的滅菌離心管中加入20 μL雙鏈cDNA、6 μL pGADT7-Rec、20 μL變性處理的鮭魚精、600 μL酵母Y187感受態(tài)細胞以及2.5 mL新鮮配制的PEG/LiAc溶液，輕輕混勻，30℃溫育45 min，加入160 μL DMSO，42℃水浴20 min，700 r/min離心5 min，棄上清，重懸沉淀于3 mL YPD Liquid Medium中。30℃搖晃培養(yǎng)90 min。700 r/min離心5 min，棄上清，重懸沉淀于30 mL 0.9％ NaCl中。

1.2.4cDNA文庫的質(zhì)量評定 轉(zhuǎn)化后的懸浮液分別稀釋10、100、1 000和10 000倍，涂布150 μL稀釋液在100 mm SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)，統(tǒng)計菌落數(shù)量，計算轉(zhuǎn)化率，平均轉(zhuǎn)化率（每微升 pGADT7-Rec的轉(zhuǎn)化子數(shù)）=平板單克隆數(shù)量×稀釋倍數(shù)×150。用含有25％甘油的YPD冷凍培養(yǎng)基重懸浮、合并所有SD/-Leu固體培養(yǎng)基上的陽性克隆，采用相同的方法稀釋菌液，用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞濃度。文庫滴度=平板上單菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10/mL。采用PCR檢測法計算文庫重組率，隨機挑取單克隆菌落作為模板（由于酵母屬于真核細胞，細胞壁較厚，需反復凍融裂解細胞，以裂解過的細胞液為模板），用pGADT7-Rec通用引物進行菌液PCR，上游引物：5'-CTATTCGATGATGAAGATA CCCCACCAAACCC-3'，下游引物：5'-GTGAACTTGC GGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。重組率計算方法為：

1.2.5誘餌載體的酵母雙雜交篩選 從涂布有誘餌載體轉(zhuǎn)化菌液的SD/-Trp固體平板上挑取菌落，在SD/-Trp液體培養(yǎng)基上30℃過夜培養(yǎng)至OD600超過0.8。離心棄上清，重懸浮于3 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基，加入1 mL雷竹cDNA文庫菌液，在2 L錐形瓶中用45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基30℃、50 r/min孵育約20 h。離心棄上清，用0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸浮涂布于營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d。

1.2.6酵母共轉(zhuǎn)化驗證 將篩選到的陽性菌斑擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，PCR檢測插入片段的大小，將大于500 bp的單克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到的陽性單克隆送上海生工生物工程公司測序。

將提取的含有互作基因的文庫酵母質(zhì)粒與pGADT7-Rec分別同pGBKT7-PvSOC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)細胞，涂布于缺失固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu上，30℃培養(yǎng)2-3 d，菌落小量培養(yǎng)后懸滴于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)觀察生長情況。

2　結(jié)果

2.1誘餌載體的構(gòu)建

以雷竹cDNA為模板擴增SOCl基因，得到條帶單一的約681 bp的產(chǎn)物（圖1-A），將目的片段連接到T-Vector pMD19（simple），送公司測序，結(jié)果證實與雷竹SOCl序列一致，用EcoR I和Sal I雙酶切pMD19-PvSOC1和空載pGBKT7質(zhì)粒，獲得含有相同黏性末端的目的片段和線性載體，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，小量雙酶切重組質(zhì)粒得到與預期大小一致的目的條帶（圖1-B），說明誘餌載體pGBKT7-PvSOC1構(gòu)建成功。

圖1　PvSOC1片段擴增（A）及誘餌載體雙酶切（B）電泳圖

2.2誘餌蛋白載體自激活和毒性檢測

用誘餌載體與空載體分別轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，轉(zhuǎn)化菌落可以在SD/-Trp上生長獲得白色菌落，直徑大于2 mm，藍白斑篩選實驗未變色，且誘餌載體和對照相比生長速度無明顯差距。說明誘餌載體沒有毒性，且不具有自激活性，可以用于下一步篩選實驗。

2.3雷竹cDNA文庫建立和質(zhì)量評定

提取雷竹不同部位不同時間混合樣品總RNA，電泳檢測RNA的完整性。結(jié)果（圖2）顯示，總RNA有3條帶，28S和18S條帶清晰，28S亮度約為18S的2倍且5.8S較弱，說明總RNA完整性好，未發(fā)生降解，符合建庫要求。以此RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并經(jīng)雙鏈cDNA過柱純化，除去小片段（圖3）。經(jīng)計算，得到的文庫平均轉(zhuǎn)化率為每微克pGADT7-Rec 3.0×106轉(zhuǎn)化子，文庫細胞濃度約為9.0×106/mL，文庫滴度約為7.5×106cfu/mL。隨機挑取24個文庫單克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用載體通用引物進行質(zhì)粒PCR檢測插入片段的大小，結(jié)果（圖4）顯示插入片段主要在250-2 000 bp之間，總體結(jié)果說明文庫質(zhì)量滿足進一步的實驗需求。

圖2　總RNA電泳圖

圖3　未純化（A）和純化后（B）的雙鏈cDNA電泳圖

圖4　陽性克隆質(zhì)粒檢測電泳圖

2.4篩選與PvSOC1相互作用的文庫蛋白

以PvSOC1為誘餌蛋白進行酵母雙雜交篩選雷竹cDNA文庫，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2-3 d長出藍色菌斑（圖5），菌落PCR檢測（圖6），除去含有500 bp以下小片段的單克隆后，將得到的單克隆擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒并送生物公司測序。

圖5　互作蛋白的篩選

圖6　質(zhì)粒驗證互作蛋白

2.5相互作用酵母體內(nèi)驗證

將陽性單克隆文庫質(zhì)粒（陽性對照）及pGADT7-Rec空載體質(zhì)粒（陰性對照）分別與誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7-PvSOC1共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)細胞，涂布于SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d，挑取陽性單克隆并小量活化，懸滴法在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)皿上點板，30℃倒置培養(yǎng)。結(jié)果（圖7）表明，在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上陽性對照組都能正常生長，而在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上，只有一個陽性對照單克隆變藍，說明篩選到一個文庫蛋白與誘餌蛋白真正存在相互作用。

2.6目標蛋白的生物信息學分析

對篩選到的蛋白進行生物信息學分析，結(jié)果顯示，該蛋白編碼基因cDNA全長為1 721 bp，含有一個完整的ORF序列，長度為1 377 bp，編碼459個氨基酸，蛋白分子量約為50.22 kD，等電點為6.98。

將該蛋白的氨基酸序列在NCBI中進行blastp分析，顯示該蛋白和水稻、玉米、高粱中的同源序列一致性達到77％、76％和70％，利用生物學軟件進行不同物種間該蛋白氨基酸序列比對（圖8），顯示該蛋白的特征氨基酸序列在不同物種中較為保守，結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白屬于 LRR-RI超家族，是一個富含亮氨酸的類受體蛋白激酶。不同物種中的該同源蛋白聚類分析（圖9）顯示，雷竹和水稻聚為一支，親緣關(guān)系最近。

3　討論

圖8　不同物種中目標蛋白序列比對圖

近年來關(guān)于高等植物開花的研究非常多，已經(jīng)確定的開花途徑有自主途徑、光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑，各條途徑不是獨立發(fā)揮作用，而是相互聯(lián)系和影響，協(xié)同控制開花，4條途徑的相應(yīng)基因組成響應(yīng)外源信號和協(xié)同自身發(fā)育狀況的通路共同對開花時期進行控制［12］。以模式植物擬南芥和金魚草等為材料，通過對突變體的研究與分子克隆等手段，分離和研究了許多參與植物開花過程的關(guān)鍵基因，如SOCl、FLC、FT等，4條開花途徑主要通過調(diào)節(jié)這些整合因子的表達水平來調(diào)節(jié)花發(fā)育和控制開花時間［13-15］。找到與這些整合因子有相互作用的其他已知或未知蛋白可以幫助我們更好地研究植物開花機制。雖然植物開花研究得很多，但是調(diào)控開花的機制在分子層面的闡述還不是很完善［16］，與竹子開花相關(guān)的研究更少［17］。

圖9　不同物種中目標蛋白聚類分析

酵母雙雜交技術(shù)自報道以來，已被廣泛應(yīng)用于確定生物體中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系［18］。同時構(gòu)建cDNA文庫是分子生物學中常用的一種方法，而cDNA文庫和酵母雙雜交技術(shù)相結(jié)合可以更方便地研究已知蛋白與靶蛋白之間的互作關(guān)系，對研究功能特異性的蛋白有重要作用。目前關(guān)于構(gòu)建竹子酵母雙雜交cDNA文庫的報道還很少。本實驗成功構(gòu)建了花期雷竹酵母雙雜交cDNA文庫，并篩選到與雷竹SOC1蛋白存在相互作用的蛋白，對后續(xù)研究雷竹開花奠定了重要的實驗基礎(chǔ)，而實驗中僅選擇了一小部分陽性單克隆進行驗證和測序，尚有許多后續(xù)工作需要進行，相信會有更多的文庫靶蛋白被鑒定出來，從而進一步研究這些蛋白在雷竹開花時期的功能。

很多實驗表明，SOC1蛋白與很多激酶存在相關(guān)性。有研究顯示，在蛋白激酶Casein Kinase2 α-Subunits（CKAs）突變體擬南芥中，SOCl的表達與野生型中SOCl的表達有明顯差異［19］，表明SOC1的含量變化是激酶的突變效應(yīng)之一。同時，與野生型相比，在同一生長階段，ckala2a3三突變體中開花整合因子FT和SOCl的表達量大量減少，表現(xiàn)為影響開花時間［20］。還有證據(jù)表明，在擬南芥中開花整合因子SOC1能夠影響氣孔開放，而蛋白質(zhì)磷酸化酶PP1是植物葉片藍光信號途徑中的重要成員［21］，后者與氣孔開放相關(guān)，暗示SOC1蛋白的磷酸化或去磷酸化可能會影響其功能進而參與調(diào)控植物生命活動。

本實驗構(gòu)建了開花時期的雷竹cDNA文庫，并篩選到了一個與開花整合因子SOC1存在相互作用的蛋白激酶，為雷竹開花過程相關(guān)基因的克隆和功能研究提供了很好的前提條件，篩選的目標蛋白激酶的特征氨基酸序列在不同物種中非常保守，推測其功能也可能具有保守性并在植物開花過程中發(fā)揮作用，但是關(guān)于該激酶的具體功能及其作用機制還有待進一步的研究。

4　結(jié)論

成功構(gòu)建了雷竹開花時期可用于酵母雙雜交的cDNA文庫，文庫的轉(zhuǎn)化率為每微克pGADT7-Rec 3.0 ×106轉(zhuǎn)化子，文庫滴度為7.5×106cfu/mL，插入片段主要在250-2 000 bp之間。利用該cDNA文庫得到與誘餌蛋白PvSOC1相互作用的蛋白，經(jīng)鑒定靶標蛋白是一個富含亮氨酸的蛋白激酶，不同物種中的同源蛋白都含有此特征氨基酸序列，且與水稻中的同源蛋白親緣性最高。

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（責任編輯 李楠）

Screening for the Interaction Proteins of SOC1 from Phyllostachys violascens Using Yeast Two-Hybrid System

PAN Xian-fei SHI Quan LIN Xin-chun XU Ying-wu CAO You-zhi
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A ＆amp; F University，Lin'an 311300）

This work aims to study the target proteins of suppressor of overexpression of constans1（SOCl）in flowering way of Phyllostachys violaceus and to explore the action mechanism of SOCl. The pGBKT7-PvSOC1 vector was constructed as the bait protein，then the cDNA library of P. violascens flowering was established using SMART technology，and the interaction proteins with SOC1 were screened by yeast two-hybrid system as well as analyzed and identified. The results showed that the cDNA library for yeast two-hybrid was constructed successfully，the conversion rate of the library was about 3.0×106converters per μg pGADT7-Rec，and the capacity of the library was up to 7.5×106cfu/mL and the insert fragments were distributed from 0.25 kb to 2 kb. The protein interacted with the bait protein PvSOC1 was screened through the yeast two-hybrid technology. The screened target protein was identified as a protein kinase containing plentiful leucine which amino acid sequence was very conservative in different species，and had the highest affinity with rice.

Phyllostachys violascens；SOC1；cDNA library；yeast two-hybrid；protein interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.030

2016-01-20

國家自然科學基金項目（31270715），浙江農(nóng)林大學人才啟動基金項目（2012FR079）

潘現(xiàn)飛，男，碩士，研究方向：生物大分子結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：panxianfei0829@163.com

曹友志，男，博士，研究方向：植物分子生物學；E-mail：yzcao@zafu.edu.cn