刁文濤王雪妍陳曉飛馮菲寧萌周伏忠

（1. 河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008；2. 河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450008）

一株基因克隆干擾菌的鑒定及其發(fā)酵液降解DNA活性分析

刁文濤1，2王雪妍2陳曉飛1馮菲1寧萌2周伏忠1，2

（1. 河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008；2. 河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450008）

旨在尋找導(dǎo)致基因克隆失敗的原因，檢測(cè)整個(gè)電泳環(huán)境中是否存在對(duì)DNA有強(qiáng)降解力的菌株。依據(jù)菌體形態(tài)，革蘭氏反應(yīng)以及16S rDNA序列對(duì)DNA降解菌株進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析菌株對(duì)DNA的降解活性。結(jié)果顯示，從DNA電泳槽中分離到了一株菌，革蘭氏染色鑒定為陰性菌，對(duì)該菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，利用質(zhì)粒pUC19作為底物，檢測(cè)該菌發(fā)酵液對(duì)DNA的降解能力，發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液能夠迅速并徹底地降解DNA，其最佳降解溫度為45℃，將該菌命名為DD（DNA degrading）。對(duì)該菌的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)其與粘質(zhì)沙雷氏菌（Serrtia marcescens）的16S rDNA序列同源性高達(dá)100％ 。結(jié)合菌體形態(tài)，革蘭氏反應(yīng)以及16S rDNA序列結(jié)果，DD菌株為一株粘質(zhì)沙雷氏菌，DNA降解活性分析顯示其具有很強(qiáng)的DNA降解能力。

DNA降解；pUC19；粘質(zhì)沙雷氏菌

現(xiàn)代生命科學(xué)的許多領(lǐng)域都會(huì)用到分子克隆技術(shù)來(lái)構(gòu)建重組載體，在分子克隆的過(guò)程中，一般會(huì)利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)目的基因片段進(jìn)行酶切，回收酶切后的目的基因片段連接到指定的載體中，回收目的基因時(shí)一般會(huì)用到瓊脂糖凝膠回收的方法對(duì)目的基因片段進(jìn)行純化［1］。而本實(shí)驗(yàn)室利用瓊脂糖凝膠回收的方法回收酶切后目的基因片段，再連接到特定的載體中時(shí)，屢屢失敗，轉(zhuǎn)化平板上無(wú)克隆長(zhǎng)出，而利用酚氯仿異戊醇抽提沉淀的方法代替瓊脂糖凝膠回收來(lái)回收酶切后目的基因片段［1］，然后再連接轉(zhuǎn)化就可獲得很多陽(yáng)性克隆，說(shuō)明在利用瓊脂糖凝膠法回收目的基因時(shí)，目的基因遭到了破壞，一種可能就是在電泳緩沖液中存在DNA水解酶，在DNA電泳的過(guò)程中就對(duì)DNA進(jìn)行了部分水解。

電泳槽中的DNA水解酶極有可能來(lái)自于槽中的微生物，于是我們?nèi)‰娪静蹆?nèi)的電泳液進(jìn)行涂板培養(yǎng)，分離到的粘質(zhì)沙雷氏菌就是一種能夠分泌DNA水解酶的細(xì)菌［2］。粘質(zhì)沙雷氏菌又稱(chēng)靈桿菌，能夠分泌靈菌紅素而呈紅色［3-6］，屬革蘭氏陰性菌，分布廣泛，在土壤、水體和植物中都有分布，對(duì)人類(lèi)、昆蟲(chóng)和真菌都可致?。?-12］。為了適應(yīng)多種多樣的環(huán)境，有效利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)，粘質(zhì)沙雷氏菌可以分泌多種酶［2，8，10-16］，而DNA水解酶就是其中的一種，其水解核酸時(shí)對(duì)核酸的長(zhǎng)度和序列無(wú)特異性要求，而且對(duì)DNA和RNA都有同樣的水解效果［17，18］。

本研究利用質(zhì)粒pUC19作為底物檢測(cè)篩選到的菌株DD的DNA降解能力，旨在檢測(cè)DNA電泳系統(tǒng)中該菌株的污染是否為導(dǎo)致分子克隆失敗的原因。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒 pUC19（天根生化科技有限公司）。

1.1.2主要試劑 DNA膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）、細(xì)菌基因組提取試劑盒（OMEGA）、革蘭氏染色試劑盒（北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、Tris、乙酸、EDTA等。

1.1.3培養(yǎng)基 YPD固體及液體培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌株分離 取200 μL DNA電泳槽中的TAE電泳緩沖液均勻涂布在YPD固體平板上，25℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取單克隆并在新鮮的YPD平板上劃線，重復(fù)3次，挑取單克隆進(jìn)行保存，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2DNA降解 在0.3 μg質(zhì)粒pUC19（10 μL）的水溶液中加入1 μL DD（DNA degradation）菌的培養(yǎng)16 h的發(fā)酵液，在一定條件下反應(yīng)一段時(shí)間后，通過(guò)加熱終止反應(yīng)，然后用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)EB（溴化乙腚）染色后，在紫外光下觀察DNA降解情況。

1.2.3菌株鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取了DD菌的基因組DNA，以其為模板，通過(guò)PCR（引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min），獲得該菌的16S rDNA，然后對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，并對(duì)培養(yǎng)2 d的DD菌的菌落形態(tài)進(jìn)行簡(jiǎn)單觀察。

2　結(jié)果

2.1菌株分離

從DNA電泳槽中取200 μL TAE電泳緩沖液均勻涂布在YPD固體平板上，25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，長(zhǎng)出了許多相似的菌落，挑取單個(gè)菌落在新鮮的YPD平板上劃線，重復(fù)3次，得到了如圖1-A所示的菌落，菌落為紅色，突起，中心不透明，邊緣不規(guī)則，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)該菌，菌落形態(tài)如圖1-B所示，菌落為白色，革蘭氏染色的結(jié)果如圖1-C所示，表明該菌為革蘭氏陰性菌。

圖1　DD菌的菌落形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果

2.2發(fā)酵液對(duì)DNA降解能力的檢測(cè)

挑取單一菌落接種到2 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)16 h后，14 000 r/min離心10 min后收集上清液，經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾。在10 μL質(zhì)粒pUC19水溶液中加入1 μL發(fā)酵液，25℃反應(yīng)2 h，以新鮮的YPD培養(yǎng)基作為對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)發(fā)酵液處理的pUC19被徹底降解，說(shuō)明DD菌的發(fā)酵液對(duì)DNA具有明顯的降解活性。按照上述方法25℃反應(yīng)不同時(shí)間，并在70℃處理10 min終止反應(yīng)，電泳結(jié)果如圖3所示。可見(jiàn)，DD菌的發(fā)酵液能夠迅速的降解DNA，具有很強(qiáng)的降解能力。

圖2　瓊脂糖凝膠電泳分析DD發(fā)酵液的DNA降解活性

圖3　瓊脂糖凝膠電泳分析DD發(fā)酵液處理DNA不同時(shí)間的結(jié)果

2.3發(fā)酵液的DNA水解活性失活溫度檢測(cè)

為了檢測(cè)發(fā)酵液的最高耐受溫度，在不同溫度下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行10 min預(yù)處理，然后再加入到質(zhì)粒pUC19的溶液中進(jìn)行反應(yīng)，25℃反應(yīng)30 min后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，DD發(fā)酵液降解DNA的能力在50℃時(shí)開(kāi)始受到不可逆的破壞，55℃處理10 min基本可以完全破壞其DNA降解能力。

圖4　瓊脂糖凝膠電泳分析經(jīng)不同溫度處理的發(fā)酵液的DNA降解活性

2.4發(fā)酵液最佳降解溫度檢測(cè)

為了檢測(cè)DD菌的發(fā)酵液降解DNA的最適溫度，在不同的溫度條件下進(jìn)行了降解反應(yīng)，為了降低反應(yīng)速度以便觀察，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了2倍稀釋?zhuān)?0 μL 質(zhì)粒pUC19水溶液中加入1 μL稀釋后的發(fā)酵液，在不同的溫度條件下反應(yīng)5 min，然后70℃處理10 min終止反應(yīng)。電泳結(jié)果（圖5）顯示，DD發(fā)酵液降解DNA的最適反應(yīng)溫度在45℃附近。

圖5　瓊脂糖凝膠電泳分析經(jīng)不同溫度下發(fā)酵液的DNA降解活性

2.5菌株鑒定

用引物27F/1492R對(duì)DD菌的基因組進(jìn)行擴(kuò)增得到了其16S rDNA片段，測(cè)序后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與粘質(zhì)沙雷氏菌的16S rDNA序列的匹配度達(dá)到100％。圖1中DD菌的菌落形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果也作為菌種鑒定的依據(jù)。

3　討論

在尋找分子克隆實(shí)驗(yàn)的失敗原因的過(guò)程中，我們從電泳槽中分離到了一株具有很強(qiáng)的DNA降解能力的細(xì)菌，其與粘質(zhì)沙雷氏菌的16S rDNA序列匹配度達(dá)到100％，其菌落形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果也符合粘質(zhì)沙雷氏菌的特征，粘質(zhì)沙雷氏菌在28℃左右因合成靈菌紅素而呈紅色，而溫度升高到37℃時(shí)因靈菌紅素合成途徑關(guān)閉而呈白色［19］，這與該菌菌落顏色隨溫度而變化的特點(diǎn)也一致，其胞外物質(zhì)具有降解DNA的能力也與文獻(xiàn)［2］報(bào)道相符，綜合這些結(jié)果可以確定該菌為一株粘質(zhì)沙雷氏菌。本研究檢測(cè)了該菌株分泌的核酸酶對(duì)質(zhì)粒pUC19的降解能力，其分泌物在室溫條件下能夠快速的降解DNA，這可能就是導(dǎo)致利用瓊脂糖凝膠回收的DNA片段進(jìn)行連接時(shí)總是失敗的原因。在本實(shí)驗(yàn)室中，瓊脂糖凝膠電泳回收DNA后，對(duì)回收的DNA進(jìn)行再次電泳檢測(cè)時(shí)，雖然能夠看到清晰的大小正確的目的基因片段，但是連接仍然失敗，而利用酚氯仿異戊醇抽提沉淀的方法代替瓊脂糖凝膠回收來(lái)回收酶切后目的基因片段時(shí)，就可成功地將目的基因連接到載體中，說(shuō)明導(dǎo)致回收DNA片段連接失敗的原因可能是DNA在電泳時(shí)，其末端被水解掉了很少幾個(gè)核苷酸殘基，也說(shuō)明DNA對(duì)該菌分泌的核酸酶極為敏感，與本研究中檢測(cè)到的該菌發(fā)酵液對(duì)DNA的強(qiáng)大的降解能力相符，少量的污染即能夠短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致DNA的部分水解而影響分子克隆實(shí)驗(yàn)。所以進(jìn)行分子克隆的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中應(yīng)盡量避免接觸粘質(zhì)沙雷氏菌，一經(jīng)污染，便會(huì)嚴(yán)重影響分子克隆實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。

雖然本研究檢測(cè)到粘質(zhì)沙雷氏菌可能會(huì)是導(dǎo)致基因克隆失敗的原因，但是其分泌的核酸酶作為唯一一種能降解所有形式核酸的水解酶，在蛋白質(zhì)純化等需要除去核酸的工藝中還是有著顯著的應(yīng)用價(jià)值［18，20，21］。

4　結(jié)論

結(jié)合菌體形態(tài)，革蘭氏反應(yīng)以及16S rDNA序列結(jié)果，推斷DD菌株為一株粘質(zhì)沙雷氏菌，其胞外分泌物在50℃以下具有很強(qiáng)的DNA降解能力，最適降解溫度在45℃左右。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of a Bacterium Disturbing Molecular Cloning，and Analysis of DNA-Degrading Activity of Its Fermentation Broth

DIAO Wen-tao1，2WANG Xue-yan2CHEN Xiao-fei1FENG Fei1NING Meng2ZHOU Fu-zhong1，2
（1. Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou 450008；2. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008）

This work aims to analyze the reason that resulted in the failure of cloning and to check if there are some microorganisms strongly degrading DNA in the environment of electrophoresis chamber. The colony morphology，gram staining and the 16S rDNA sequence were utilized to identify the strain degrading DNA，and agarose gel electrophoresis was for analyzing the DNA-degrading activity. As results，a strain was isolated from DNA electrophoresis chamber，and identified as gram-negative bacterium. Then it was cultured in YPD medium，and the capacity of the fermentation broth degrading DNA was detected using plasmid pUC19 as substrate. The strain quickly and sufficiently degraded DNA at the optimal temperature 45℃，thus this strain was designated DD（DNA degrading）. The sequence alignment of the DD by the 16S rDNA showed that this DD had 100％ identity with the that of Serrtia marcescens. Conclusively，the bacterial strain DD isolated from DNA electrophoresis chamber is a Serrtia marcescens strain possessing significant DNA-degrading activity based on the results of colony morphology，gram staining，and 16S rDNA sequence.

DNA degradation；pUC19；Serratia marcescens

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.032

2015-12-08

河南省省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)項(xiàng)（122300413214），河南省重點(diǎn)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（142102210087，152102210167）

刁文濤，男，博士，研究方向：微生物資源和分子遺傳；E-mail：diao_wen_tao@163.com

周伏忠，男，碩士，研究方向：微生物資源研究與產(chǎn)品研發(fā)；E-mail：zdsyszfz001@163.com