畢 瑋，吳 濤，耿云芬，原曉龍，王 娟

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室、云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)-新西蘭森林植物培育與開發(fā)利用聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

新西蘭麻組培技術(shù)初探

畢 瑋1，2，吳 濤1，2，耿云芬1，2，原曉龍1，2，王 娟1，2

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室、云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)-新西蘭森林植物培育與開發(fā)利用聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

以新西蘭麻種子為外植體材料，進(jìn)行組培試驗(yàn)，建立離體培養(yǎng)技術(shù)體系。結(jié)果表明，以75%酒精消毒60 s，再用0.1% HgCl2消毒5 min的效果最好；叢生芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1；誘導(dǎo)不定根的適宜培養(yǎng)基為MS+IBA 1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；生根組培苗煉苗移栽30 d后，成活率達(dá)84%以上。

新西蘭麻；組織培養(yǎng)；消毒方法；培養(yǎng)基

新西蘭麻(PhormiumtenaxForst)隸屬于天門冬目刺葉樹科(Xanthorrhoeaceae)萱草亞科(Hemerocallidoideae)新西蘭麻屬(Phormium)。新西蘭麻無中央直立莖，劍形的葉片，葉長(zhǎng)0.9～4.2 m，寬2.5～12.7 cm，葉色因品種而異，葉背具白霜?；ㄝS從扇式的葉片中心長(zhǎng)出，高2～4 m，紅紫色圓錐花序。一枚花葶可產(chǎn)蒴果100余個(gè)，蒴果直立，有三棱。新西蘭麻原產(chǎn)于新西蘭和澳大利亞的諾?？藣u，后引入亞速爾群島、圣赫勒拿、阿根廷、智力和南非，現(xiàn)已廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)[1]。新西蘭麻適宜在沼澤與河流附近的沖積地生長(zhǎng)，喜肥沃濕潤(rùn)、排水良好的土壤。其適應(yīng)性較強(qiáng)，能耐酸堿土壤，耐空氣污染。不耐寒，生長(zhǎng)室溫15～25 ℃，越冬溫度為8～10 ℃[2]。因有較強(qiáng)的生命力、耐旱性，并對(duì)海洋的“咸風(fēng)”有抗性，因此，新西蘭麻也是沿海低矮的防風(fēng)帶種植樹種[3]。

新西蘭麻不僅是新西蘭獨(dú)具特色優(yōu)勢(shì)的天然纖維原料，而且觀賞性好，綜合用途廣，發(fā)展前景十分廣闊。新西蘭麻現(xiàn)有20多個(gè)栽培品種，葉色有綠色、紅色、粉紅色、深赤褐色的青銅和黃色，是國(guó)外流行的園林美化樹種和插花葉材。新西蘭麻可謂渾身是寶，花是上等的蜜源；莖含有膠質(zhì)，可作為蠟或漿粉的替代品；新鮮葉片可以當(dāng)紙用，干的可以作火絨，還可以搓繩子、造纜索、織漁網(wǎng)，或者編成被褥、大衣、席子或麻布[4]。

目前，我國(guó)對(duì)新西蘭麻的研究報(bào)道較少。本文對(duì)新西蘭麻組培技術(shù)進(jìn)行初步研究，建立叢生芽誘導(dǎo)和植株再生體系，使其種質(zhì)資源得到保存與繁殖，以期為遺傳育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為新西蘭麻種子，由新西蘭皇家植物食品研究所提供。

1.2 研究方法

所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，0.5%～0.7%瓊脂，活性炭0.5 g·L-1，調(diào)整pH值的范圍在5.8±2。培養(yǎng)溫度為(26±2) ℃，光照度為30～50 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為12 h·d-1。

1.2.1 外植體消毒處理試驗(yàn) 新西蘭麻的種子較小，挑選出外皮色澤鮮明、顆粒飽滿的種子，用5%洗潔精水浸泡15～30 min，流水沖洗5 min。在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30～60 s，無菌水沖洗2次，然后用0.1%升汞溶液消毒2～8 min，無菌水沖洗3次，用已滅菌濾紙吸干表面水分，接種于無添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)種子萌發(fā)并觀察其污染狀況。

在外植體消毒試驗(yàn)中，選用75%酒精和0.1%升汞溶液2種消毒溶液，設(shè)置酒精消毒時(shí)間為30 s、60 s，升汞溶液消毒時(shí)間為2、5、8 min，試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，形成6個(gè)處理(表1)。每個(gè)處理接種60粒種子，外植體消毒試驗(yàn)共接種360粒種子，觀察統(tǒng)計(jì)其污染狀況，從而篩選出效果最佳的消毒方法。

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)篩選試驗(yàn) 將消毒后的新西蘭麻種子分別接種于4種培養(yǎng)基中(表2)：1號(hào)為無MS的培養(yǎng)基，只添加糖和瓊脂；2號(hào)培養(yǎng)基為1/2 MS；3號(hào)培養(yǎng)基為MS；4號(hào)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每種培養(yǎng)基接種150粒種子。外植體啟動(dòng)培養(yǎng)試驗(yàn)共接種600粒種子，14 d后開始記錄種子萌發(fā)率，萌發(fā)率=(萌芽的胚數(shù)/接種后未污染的胚數(shù))×100%，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)狀況，篩選適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基。

1.2.3 增殖繼代培養(yǎng)試驗(yàn) 當(dāng)幼苗高約4 cm時(shí)應(yīng)及時(shí)切除胚根及芽頂部分，留1～2 cm靠近基部的莖段轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS，添加6-BA、KT 2種細(xì)胞分裂素，其中6-BA質(zhì)量濃度分別為1、2、3 mg·L-1，KT質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，形成9個(gè)處理，每個(gè)處理接種50瓶，每瓶1個(gè)幼芽，30d后觀察統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況，篩選最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基。

1.2.4 生根培養(yǎng)試驗(yàn) 選取生長(zhǎng)健壯，苗高5 cm左右的苗叢接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS，使用IBA、NAA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其中IBA質(zhì)量濃度分別為0.5、1 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0.5、1 mg·L-1，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，形成4個(gè)處理，每個(gè)處理接種150瓶，每瓶1個(gè)單株。30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)和生根率，并觀察試管苗的生長(zhǎng)情況。生根率=(生根的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.2.5 煉苗與移栽 選出高6 cm以上的健壯瓶苗移到大棚內(nèi)放置，棚內(nèi)溫度15～30 ℃，濕度為60%～70%。7 d后揭開瓶蓋，煉苗4 d后移栽到基質(zhì)中，基質(zhì)均用0.2%的高錳酸鉀溶液拌土消毒。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，比較2組基質(zhì)(紅壤∶河砂∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶2∶1、紅壤∶河沙∶腐殖土=2∶1∶2)的移栽效果。每組基質(zhì)移栽150株作為一個(gè)處理。移栽時(shí)小苗根部先用1‰的多菌靈溶液浸泡15 min，移栽后用1‰的多菌靈水溶液作定根水噴灑至基質(zhì)浸透，移栽初期需用薄膜遮蓋并保持相對(duì)濕度70%左右，小環(huán)境溫度控制在18～30 ℃。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)組培苗移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，方差分析中兩兩均數(shù)比較采用S-N-K法。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒處理

6種消毒方式對(duì)外植體的消毒效果見表1。從表1可以看出，75%酒精消毒30 s時(shí)，隨著HgCl2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率呈顯著下降趨勢(shì)，但死亡率顯著上升，說明消毒時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致外植體殺菌過度而死亡。75%酒精消毒60 s時(shí)，再結(jié)合0.1% HgCl2消毒5 min和消毒8 min，即處理5與處理6的污染率無顯著差異。從萌芽率和污染率看，新西蘭麻種子的消毒效果以處理5(75%酒精消毒60 s再結(jié)合0.1% HgCl2消毒5 min)最為理想；處理1(75%酒精消毒30 s再結(jié)合0.1% HgCl2消毒2 min)的死亡率最低，但污染率高且萌芽率低。綜合來看，處理5的效果最為理想，保證了低污染率，成活率也較高。

*：表中不同小寫字母為差異顯著。下同。

2.2 種子萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)

4種培養(yǎng)基對(duì)新西蘭麻種子在萌發(fā)率、萌發(fā)時(shí)間、整齊度和幼苗長(zhǎng)勢(shì)方面都有影響(表2)。種子接入啟動(dòng)培養(yǎng)基，多數(shù)種子14 d后開始萌發(fā)，最早的12 d能萌發(fā)并先長(zhǎng)出乳白色的胚根。4種啟動(dòng)培養(yǎng)基中，種子在全MS成分(培養(yǎng)基3和4)和1/2 MS成分(培養(yǎng)基2)三者間種子萌發(fā)率差異達(dá)到顯著水平，1/2 MS成分與無MS成分(培養(yǎng)基1)相比，種子萌發(fā)率差異顯著。在無MS成分和1/2 MS成分的培養(yǎng)基中，種子發(fā)芽時(shí)間較長(zhǎng)，植株長(zhǎng)勢(shì)弱，葉色淡，培養(yǎng)后期幼苗基部會(huì)褐化。在添加細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中萌發(fā)較早，發(fā)芽率高，但葉片不舒展，后期繼代易呈水草狀。可見適宜新西蘭麻種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS，萌發(fā)率較高，葉片舒展，葉色正常，小苗生長(zhǎng)健壯(圖1)，才能適應(yīng)下一步繼代增殖培養(yǎng)。

表2 不同培養(yǎng)基中種子萌發(fā)生長(zhǎng)情況

2.3 叢生芽的繼代增殖

增殖培養(yǎng)約14 d后，植株基部可分化出2～3個(gè)芽叢，經(jīng)3～5次繼代培養(yǎng)，可形成5個(gè)以上的叢生芽。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)幼苗在9種培養(yǎng)基的增殖狀況，結(jié)果見表3。從試驗(yàn)結(jié)果看，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度越高，叢芽分化越多。從增殖培養(yǎng)的芽苗長(zhǎng)勢(shì)來看，隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)和繼代次數(shù)的增多，5～7號(hào)培養(yǎng)基叢芽分化慢且少，生長(zhǎng)細(xì)弱；8～10號(hào)培養(yǎng)基叢芽分化良好；11～13號(hào)培養(yǎng)基芽分化密集，增殖倍數(shù)過高，幼苗易矮化色黃。因此，新西蘭麻叢生芽在9號(hào)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1)中增殖倍數(shù)最高，并且長(zhǎng)勢(shì)最好(圖2)。由于增殖培養(yǎng)需多次轉(zhuǎn)接，耗時(shí)較長(zhǎng)，一般在90 d以上，增殖階段后期，可用MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1作為交替培養(yǎng)基來壯苗繼代，以利于下一階段不定根的誘導(dǎo)。

圖1 種子萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)30d圖2 叢生芽增殖培養(yǎng)90d

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)叢芽增殖的效果

2.4 不定根的誘導(dǎo)

增殖培養(yǎng)數(shù)月后可選取高5 cm左右的健壯苗轉(zhuǎn)接到14、15、16、17號(hào)生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，根原基形成。15、16、17號(hào)培養(yǎng)基的生根率和生根數(shù)差異不顯著，但與14號(hào)培養(yǎng)基的差異達(dá)到顯著水平。50 d后，根系生長(zhǎng)分布狀況明顯(表4)。其中，14號(hào)培養(yǎng)基中IBA、NAA濃度較低生根慢，根生長(zhǎng)稀疏；15號(hào)培養(yǎng)基根系健壯均勻分布，生根快；16號(hào)培養(yǎng)基中NAA濃度較高，生根率高但根條短粗；17號(hào)培養(yǎng)基中IBA、NAA濃度均較高，根系密集成團(tuán)，基部出現(xiàn)愈傷組織。因此，根據(jù)生根率、根系生長(zhǎng)發(fā)育與分布狀況等因素綜合考慮，15號(hào)培養(yǎng)基(MS+IBA 1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1)的生根效果最優(yōu)(圖3)。

表4 生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定根情況

2.5 煉苗與移栽

挑選生根整齊、生長(zhǎng)健壯，苗高6 cm以上的植株進(jìn)行煉苗移栽(圖4)。移栽30 d后組培苗移栽成活率見表5?；|(zhì)1添加了珍珠巖，平均成活率和成活數(shù)均顯著高于基質(zhì)2。說明基質(zhì)1適宜作為新西蘭麻的移栽基質(zhì)。

圖3 生根培養(yǎng)50d圖4 煉苗移栽30d

表5 不同移栽基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

從試驗(yàn)結(jié)果看，新西蘭麻離體快速繁殖與植株再生體系的建立關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的積累作用，能有效誘導(dǎo)植物產(chǎn)生芽或促進(jìn)嫩莖增殖，所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度在不同培養(yǎng)階段有所不同[6]。細(xì)胞分裂素6-BA能促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽分化，在叢生芽增殖階段起主導(dǎo)作用。6-BA濃度低時(shí)叢芽分化少，當(dāng)6-BA濃度提高到3 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)較長(zhǎng)一段時(shí)間，又會(huì)導(dǎo)致叢芽增殖過密，葉片扭曲生長(zhǎng)，而無法達(dá)到生根的要求。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑KT與6-BA配合使用能顯著增加從芽增殖率，但KT濃度稍高葉色會(huì)變淡，也不利于從芽進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。故在增殖培養(yǎng)之后，需調(diào)低6-BA濃度壯苗，以利于生根培養(yǎng)。煉苗是組培苗移栽到土壤之前的一個(gè)關(guān)鍵步驟，組培苗從異養(yǎng)過渡到自養(yǎng)狀態(tài)，需調(diào)節(jié)平衡好外界環(huán)境與再生苗之間的關(guān)系來適應(yīng)變化的環(huán)境。

本試驗(yàn)通過種子萌發(fā)、增殖、壯苗、生根、煉苗和移栽的系統(tǒng)研究，建立了新西蘭麻種子無菌誘導(dǎo)植株再生體系，實(shí)現(xiàn)了新西蘭麻的快速繁殖，為進(jìn)一步品種改良、抗性研究等提供參考，也有利于種質(zhì)資源的保存及新西蘭麻產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)。

[1]林伯達(dá).新西蘭麻[J].The Garden，1979，103(3)：52-54.

[2]肖軍，蔡齡齡，呂梅.新西蘭麻的繁殖栽培[J].中國(guó)花卉園藝，2009(10)：44.

[3]鐘志權(quán).插花新型葉材——新西蘭麻[J].中國(guó)花卉園藝，2006，4(2)：46-47.

[4]呂德金.新西蘭麻[J].大自然，2013(2)：74-75.

[5]朱清，錢秀葦，李圃錦.新西蘭麻離體快繁技術(shù)研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25(1)：101-104.

Tissue Culture and Rapid Propagation ofPhormiumtenaxForst

BI Wei1，2，WU Tao1，2，GENG Yun-fen1，2，YUAN Xiao-long1，2，WANG Juan1，2

(1.YunnanAcademyofForestry，Kunming650201，Yunnan，China；2.YunnanLaboratoryforConservationofRare，Endangered&EndemicForestPlants，PublicKeyLaboratoryoftheStateForestryAdministration；YunnanProvincialKeyLaboratoryofCultivationandExploitationofForestPlants；China-NewZealandjointLaboratoryofCultivationandExploitationofForestPlants，Kunming650201，Yunnan，China)

The study usedPhormiumtenaxForst′s seeds as the explants，conducted the research of tissue culture techniques，and established the rapid propagation system in vitro.The results indicated that using 75% Alcohol to disinfection for 60 s and 0.1% HgCl2to disinfection for 5 min were most effective；MS+6-BA 2mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1was the optimizing medium for multipropagation；MS+IBA 1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1was the best medium for rooting；After 30 days transplanted into greenhouse，the survival rate of young plants were over 84%.

PhormiumtenaxForst；tissue culture；disinfection method；culture medium

2015-09-24；

2015-11-09

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2013FA054)；云南省科技計(jì)劃-對(duì)外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2014IA013)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2010CI016)

畢瑋(1983—)，女，云南騰沖人，云南省林業(yè)科學(xué)院助理研究員，碩士，從事林木生物技術(shù)與培育利用研究。E-mail：biwei0102@126.com。

王娟，女，云南省林業(yè)科學(xué)院教授，從事生物多樣性保護(hù)和植物分子生物學(xué)研究。E-mail：schima@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.03.037

S563；S723.1+32.6

A

1002-7351(2016)03-0178-05