李曉雯，李艷麗，陳思思，廖勇敢

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北　十堰　442000）

阿魏酸鈉與彌可保治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型大鼠心肌TGF和CTGF表達(dá)的研究

李曉雯，李艷麗，陳思思，廖勇敢

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000）

目的 探討應(yīng)用阿魏酸鈉與彌可保對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型大鼠心肌的TGF和CTGF表達(dá)的效果。方法 選取90只4個(gè)月齡的SD雄性大鼠，隨機(jī)均分為對(duì)照組、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組，每組15只，分別觀察測(cè)定實(shí)驗(yàn)后大鼠的體重、血糖、胰島素及心肌CTGF和TGF的變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，其余各組體重均下降，血糖、胰島素、心肌CTGF與TGF均有所升高，但是其余各干預(yù)組體重、血糖、胰島素、心肌CTGF與TGF指標(biāo)均比糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組有所改善，其中阿魏酸鈉與彌可保組效果更明顯（P＜0.05）。結(jié)論 阿魏酸鈉和彌可保均能抑制糖尿病大鼠心肌CTGF及TGF-β1的表達(dá)，起到心臟保護(hù)作用，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用，為臨床治療提供了借鑒。

阿魏酸鈉； 彌可保； 糖尿病周?chē)窠?jīng)病變； TGF； CTGF

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.029

收稿日期：2015-08-26；修回日期：2015-10-08

通訊作者：廖勇敢

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）屬于糖尿病的并發(fā)癥，在糖尿病的并發(fā)癥中較為常見(jiàn)［1］。目前對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是有發(fā)現(xiàn)表明促進(jìn)心肌纖維化的炎性、細(xì)胞因子-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）參與其發(fā)病過(guò)程［3］。本研究就通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，對(duì)阿魏酸鈉與彌可保治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型大鼠心肌TGF和CTGF的表達(dá)作用進(jìn)行初步探討。

資料與方法

1 一般資料及造模

本研究選取90只4個(gè)月齡的SD雄性大鼠，質(zhì)量為84～98g，均購(gòu)自湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。購(gòu)來(lái)后用鼠籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，讓其自由攝食與飲水。隨機(jī)均分為對(duì)照組、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組，每組15只。本研究使用的阿魏酸鈉，均購(gòu)自廣東眾生公司，批號(hào)為140109；彌可保，均購(gòu)自諾華制藥公司，批號(hào)為131109。

大鼠糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型的建立：對(duì)所有大鼠均禁食12小時(shí)后，①正常組（NC）15只，飼喂普通飼料，一個(gè)月后以30mg/kg劑量腹腔注射0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH 4.2，4℃）），3天后測(cè)定非同日的血糖變化，連續(xù)3次測(cè)定大鼠的空腹血糖均小于11.1mmol/L且非空腹血糖均小于16.7mmol/L，觀察一周其血糖較穩(wěn)定，為對(duì)照組鼠；②對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組的75只大鼠均進(jìn)行高脂高糖飲食（普通飼料+10%蔗糖+20%豬油），一個(gè)月后，以30mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液 （用0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH4.2，4℃）配成2%濃度），3天后測(cè)定非同日的血糖變化，連續(xù)3次測(cè)定大鼠的空腹血糖均大于11.1mmol/L且非空腹血糖均大于16.7mmol/L，觀察一周其血糖較穩(wěn)定，本次造模成功［4］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

用蒸餾水制備阿魏酸鈉溶液（15mg/mL）與彌可保溶液（15mg/mL），配制后儲(chǔ)存于4℃冰箱中。除對(duì)照組、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組灌服等容量的蒸餾水、阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組按照每天各2.5mL/kg體積給藥外，其它各組均按照每天5mL/kg體積給藥，每天1次，連續(xù)2個(gè)月，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，飼養(yǎng)大鼠的其它條件不變，均飼喂普通飼料、正常飲水等［5］。在灌胃給藥過(guò)程中，有大鼠死亡，最終進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的大鼠數(shù)量如下：對(duì)照組15只、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組14只、阿魏酸鈉干預(yù)組14只、彌可保干預(yù)組15只、阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組14只。

3 觀察指標(biāo)及標(biāo)本的采集

觀察指標(biāo)包括大鼠的一般狀態(tài)、體重、血糖以及心肌組織的TGF-β1和CTGF的測(cè)定，分別觀察各組大鼠的情況［6］。

其中一般狀態(tài)包括大鼠的精神、形體的狀態(tài)，觀察大鼠皮毛的色澤，運(yùn)動(dòng)情況等；

體重測(cè)定：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束1個(gè)月后、2個(gè)月后各記錄一次大鼠的體重，用電子稱(chēng)稱(chēng)重；

實(shí)驗(yàn)后2個(gè)月，大鼠腹腔中注射20%的烏拉坦（5mL/kg）進(jìn)行麻醉，在固定架上固定，測(cè)定迅速取出心臟，在預(yù)冷的鹽水中沖洗后進(jìn)行重量的測(cè)定。部分心肌組織置于液氮中保存，用于TGF-β1和CTGF的測(cè)定。抽取主靜脈血液進(jìn)行血糖和胰島素的測(cè)定。

血糖和胰島素的測(cè)定［7］：大鼠的血糖采用Surestep血糖儀測(cè)定，胰島素采用放免法測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照上述試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

TGF-β1和CTGF的測(cè)定［8］：采用western blot的方法測(cè)定TGF-β1和CTGF的表達(dá)量。一抗采用Sigma的兔抗鼠TGF-β1和CTGF多克隆抗體，1∶200稀釋使用。采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶2000稀釋。以光密度表示TGF-β1和CTGF的表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)文中所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并作比較分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)

除對(duì)照組外，各組大鼠均出現(xiàn)明顯多飲、多尿、多食、體重下降、皮毛污穢無(wú)光澤、精神萎靡、動(dòng)作遲緩等現(xiàn)象，各治療組大鼠情況均好于糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組，其中，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組大鼠變化改變情況最少。

2 大鼠體重變化情況

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組動(dòng)物的體重比較無(wú)顯著性變化，實(shí)驗(yàn)的第1個(gè)月與第2個(gè)月，與對(duì)照組比較各組大鼠體重均有不同程度的下降，糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組的體重下降的更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第1個(gè)月與第2個(gè)月的結(jié)果顯示，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組與糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組比較體重均上升，且阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組比阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組體重明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠體重比較（x±s，g）

3 實(shí)驗(yàn)后2個(gè)月大鼠血糖與胰島素的變化情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2個(gè)月對(duì)大鼠血糖與胰島素進(jìn)行分析，與正常對(duì)照組相比，各組大鼠血糖均顯著升高，但是除對(duì)照組以外，與糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組比較，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組血糖均降低，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組降低較為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血糖與胰島素的比較（x±s）

4 實(shí)驗(yàn)后2個(gè)月大鼠TGF-β1和CTGF表達(dá)的變化情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2個(gè)月對(duì)大鼠對(duì)大鼠TGF-β1和CTGF進(jìn)行分析，與對(duì)照組比較，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組的TGF-β1和CTGF均有所升高；除對(duì)照組以外，阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組、阿魏酸鈉干預(yù)組、彌可保干預(yù)組與糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組比較，TGF-β1和CTGF均有所降低，且阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組降低的更多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，阿魏酸鈉與彌可保均可以改善大鼠心肌細(xì)胞的TGF-β1和CTGF的表達(dá)，且同時(shí)使用具有協(xié)同作用，效果更佳。見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠TGF-β1和　CTGF表達(dá)比較（x±s，pg/mL）

討 論

近年來(lái)糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，伴隨的并發(fā)癥也不斷出現(xiàn)，醫(yī)學(xué)工作者已經(jīng)開(kāi)始對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變逐步重視，是研究的重點(diǎn)［9］。人們建立了多種用于其病理機(jī)制研究和治療藥物研究的動(dòng)物模型，有STZ誘發(fā)的大鼠、小鼠、狗、轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠自發(fā)性糖尿病模型等糖尿病動(dòng)物模型［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠模型是最為常用的糖尿病模型，因?yàn)檫@種模型在早期的功能、生化、病理等的異常變化與人類(lèi)的相似，結(jié)構(gòu)改變?cè)贗型、II型糖尿病模型中，因此，本研究選擇了注射STZ誘發(fā)大鼠糖尿病動(dòng)物模型，也是目前應(yīng)用最多的一種模型，且此模型制備方法便于操作，大鼠死亡率低。

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變中存在著心肌結(jié)構(gòu)紊亂，即心肌纖維化，其中，與糖尿病的心肌纖維化關(guān)系最密切的是血纖維蛋白溶酶原生長(zhǎng)因子，包括TGF和CTGF。TGF-β是可以使心臟纖維變性和心肌細(xì)胞肥大的生長(zhǎng)因子，它有促進(jìn)纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)等功能［11］。已發(fā)現(xiàn)TGF-β有5種異構(gòu)體（TGF-β1～TGF-β5），其中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3主要見(jiàn)于哺乳動(dòng)物，TGF-β1過(guò)度表達(dá)與心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化密切相關(guān)，TGF-β1可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、增強(qiáng)膠原酶抑制劑的表達(dá)、增加TIMP-1基因的表達(dá)。高糖環(huán)境可以上調(diào)TGF-β1和CTGF表達(dá)、活性，使左心室基質(zhì)沉積，而在糖尿病心肌纖維化中TGF-β1活化，同時(shí)伴隨著半乳糖凝集素的激活，被認(rèn)為在誘導(dǎo)組織纖維化過(guò)程中是關(guān)鍵步驟，所以本研究著重測(cè)定TGF-β1的變化情況［12］。CTGF為半胱氨酸的分泌肽，有研究發(fā)現(xiàn)CTGF對(duì)成纖維細(xì)胞具有趨化、促細(xì)胞增殖、促進(jìn)有絲分裂等的作用，CTGF與血管、心臟、胰腺、肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化相關(guān)。CTGF是與糖尿病周?chē)窠?jīng)病變心肌纖維化相關(guān)的重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，各干預(yù)組的體重、血糖、胰島素、心肌TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平均較糖尿病周?chē)窠?jīng)病變組具有較好的恢復(fù)，且阿魏酸鈉與彌可保干預(yù)組效果更好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜述所述，阿魏酸鈉與彌可保不僅能夠降脂降糖，在心血管方面的治療中也有一定的保護(hù)作用，能夠降低TGF-β1和CTGF的表達(dá)，對(duì)糖尿病的研究提供了一定的借鑒。

［1］楊祖蓉.阿魏酸鈉治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的療效觀察.四川醫(yī)學(xué)，2012，1（2）：257-258.

［2］Tsai H C，Huang C Y，Su H L，et al.CTGF increases drug resistance topaclitaxelbyupregulatingsurvivinexpressioninhuman osteosarcoma cells.Biochim Biophys Acta，2014，1843（5）：846-854.

［3］王昱.阿魏酸鈉并彌可保治療60例糖尿病周?chē)窠?jīng)病變療效觀察.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（32）：133-134.

［4］莫順瑤.阿魏酸鈉聯(lián)合高壓氧治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的護(hù)理分析.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11（35）：569-570.

［5］羅嘉，黃佳，葉茂.厄貝沙坦對(duì)2型糖尿病模型大鼠心肌TGF-β1 和CTGF表達(dá)的影響.標(biāo)記免疫分析與臨床，2015，22（7）：669-671.

［6］喬進(jìn)，施忠，竇志華，等.靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的干預(yù).中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（20）：1709-1713.

［7］習(xí)雪峰，馮守東，張林，等.游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠心肌TGF-β1/CTGF基因表達(dá)和膠原代謝的影響.河南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，44（6）：706-710.

［8］王中英，龐淑珍.阿魏酸鈉聯(lián)合彌可保治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變57例療效觀察.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2012，15（20）：34-35.

［9］鄧向軍，胡秀梅，武謙虎.伊伐布雷定對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制探討.安徽醫(yī)藥，2014，18（12）：2248-2250.

［10］王國(guó)賢，康雅萍，李飛.α-硫辛酸對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，22（5）：378-381，386.

［11］Cheng M，Liu F，Peng Y，et al.Construction of a CTGF and RFP coexpressed renal tubular epithelial cell and its application on evaluation of CTGF-specific siRNAs on epithelial-mesenchymal transition.Urology，2014，83（6）：e1-8.

［12］劉根林，袁風(fēng)菊，陸慈溧，等.銀杏葉提取物對(duì)Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠心肌TGF-β1和collagen表達(dá)及間質(zhì)纖維化的影響.中國(guó)病理生理雜志，2013，29（11）：2017-2023.

（李 凌編輯）

Expression of Myocardial TGF and CTGF in Diabetic Peripheral Neuropathy Model Rat After Treatment with Sodium Ferulate and Mecobalamin

LI Xiao-wen，LI Yan-li，CHEN Si-si，LIAO Yong-gan
（Endocrine DepartmentPeople's Hospital Affiliated to Hubei Medical College，Shiyan 442000，China）

Objective To investigate the effect of sodium ferulate and Mecobalamin on myocardial TGF and CTGF expression in diabetic peripheral neuropathy model rat.Methods Ninety of four month old male SD rats were randomly divided into normal control group，diabetes peripheral neuropathy group，sodium ferulate intervention group，Methycobal intervention group，ferulic acid sodium and mecobalamin intervention group，with 15 rats in each group.The changes of rat body weight，blood glucose，insulin and myocardial CTGF and TGF were measured after the experiment.Results Compared with normal control，the body weight in other groups were decreased，but the blood glucose，insulin，myocardial CTGF and TGF levels were increased.The above indexes in intervention group were improved compared with the diabetic peripheral neuropathy group，and sodium ferulate combined with methylcobalamin intervention group showed Bulgaria effect more obviously（P＜0.05）. Conclusion Sodium ferulate and Methycobal can inhibit expression of myocardial CTGF and TGF beta 1 in diabetic rats.The combination of two drugs has a synergistic effect and provides the reference for the clinical treatment.

Ferulic acid sodium； Methylcobalamin； Diabetic peripheral neuropathy； TGF； CTGF