譚屬瓊，謝勇武

(福建師范大學(xué) 閩南科技學(xué)院，福建 泉州　362332)

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超聲波輔助酶法優(yōu)選花生芽中白藜蘆醇提取工藝

譚屬瓊，謝勇武

(福建師范大學(xué) 閩南科技學(xué)院，福建 泉州362332)

以花生芽為原料，采用纖維素酶-超聲波復(fù)合處理從花生芽中提取白藜蘆醇，結(jié)合單因素試驗(yàn)研究了酶的酶解溫度、酶添加量、pH值、酶解時(shí)間和超聲波對(duì)樣品的處理溫度、處理時(shí)間、乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))、料液比等8個(gè)因素對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響，并且通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。結(jié)果表明：花生芽中白藜蘆醇最優(yōu)提取工藝為花生芽粉為1.000g，酶解溫度為60℃，酶添加量為0.2g，pH值為4.8，酶解時(shí)間為2.0h，超聲波處理溫度為60℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，超聲波處理時(shí)間為50min，在此條件下花生芽中白藜蘆醇的最大提取量為7.39mg/g，比傳統(tǒng)的乙醇回流法提高了大約4.6倍。

花生芽；白藜蘆醇；纖維素酶酶解；超聲波處理

0　引言

花生種子發(fā)芽后可以作為芽菜食用，稱(chēng)為花生芽，又稱(chēng)長(zhǎng)壽芽?；ㄉ坷锏陌邹继J醇含量比花生的各個(gè)部位所含有量都多，花生發(fā)芽后，其蛋白質(zhì)已分解為氨基酸，由于其脂肪含量低，維生素含量則全面提高，各種營(yíng)養(yǎng)成分更易被人體吸收[1]?；ㄉ枯^好生長(zhǎng)，大概1～2周就可以長(zhǎng)到10cm左右，芽菜是我國(guó)2000年前就已流行的一種保健蔬菜，具有營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)；芽菜中還含有較多的維生素B1和B2，礦質(zhì)元素，特別是磷，在芽苗菜中也較豐富，而且種子中富含磷，在萌芽及芽苗生長(zhǎng)時(shí)，其以無(wú)機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)移到芽苗當(dāng)中，便于人體吸收、消化[2]。

白藜蘆醇俗稱(chēng)芪三酚，化學(xué)名稱(chēng)為3,4,5-三羥基二苯乙烯(3,4,5-trihy-drolystilbence)，化學(xué)式為C14H12O3，分子量228.25，是含芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的二苯乙烯芪類(lèi)、非黃酮類(lèi)多酚物質(zhì)[3]。于1924年首次發(fā)現(xiàn)，主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹(shù)、買(mǎi)麻藤等12科、31個(gè)屬72種植物中[4]，白藜蘆醇是生物或非生物對(duì)植物本身刺激(如陽(yáng)光照射)所產(chǎn)生的一種植物抗毒素，研究表明，白藜蘆醇對(duì)乳腺癌[5，6]、結(jié)腸癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞均有顯著抑制作用，還具有抗炎，抗氧化[8]等多種對(duì)人體有好處的生理功能，國(guó)外已有白藜蘆醇相關(guān)的保健品上市，有膠囊、片劑和口服液等類(lèi)型[9]，近幾年，白藜蘆醇被國(guó)內(nèi)外廣泛的提取出來(lái)并應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域[10]，因此對(duì)其提取研究有著重要意義。研究以福建龍巖花生仁為原料，花生仁中營(yíng)養(yǎng)豐富，花生芽中白藜蘆醇含量很多，因此使用超聲波輔助酶法優(yōu)選提取白藜蘆醇，為樣品前萃取提供一種經(jīng)濟(jì)可靠實(shí)用的提取方法，且進(jìn)一步拓展超聲波輔助酶法的具體應(yīng)用范圍。

1　材料與方法

1.1材料

原料：花生，購(gòu)于龍巖，新鮮，市售；纖維素酶，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

主要試劑：白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、無(wú)水乙醇、甲醇均為分析純，甲醇含量≥99.9%，乙醇含量≥99.7%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1主要工藝流程

1)纖維素酶酶解：花生→發(fā)芽(發(fā)芽機(jī)，50h可長(zhǎng)10～15cm，每天換水)→洗凈→瀝干→烘干(50℃烘24h)→粉碎→過(guò)篩(過(guò)40目篩，貯于干燥器中備用)→纖維素酶酶解提取→減壓過(guò)濾→乙醇定容→測(cè)定吸光度值→分析計(jì)算；

2)超聲波處理：花生→發(fā)芽→洗凈→瀝干→烘干(50℃烘24h)→粉碎→過(guò)篩(過(guò)40目篩，貯于干燥器中備用)→超聲波提取→減壓過(guò)濾→乙醇定容→測(cè)定吸光度值→分析計(jì)算；

3)酶解-超聲波復(fù)合強(qiáng)化處理：花生→發(fā)芽→洗凈→瀝干→烘干(50℃烘24h)→粉碎→過(guò)篩(過(guò)40目篩，貯于干燥器中備用)→纖維素酶酶解提取→超聲波提取→減壓過(guò)濾→乙醇定容→測(cè)定吸光度值→分析計(jì)算。

1.2.2白藜蘆醇含量計(jì)算

準(zhǔn)確將抽濾后的樣品轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用乙醇稀釋到刻度線(xiàn)，搖勻，作為樣品液，于306nm處測(cè)定吸光度，由回歸線(xiàn)性方程得出白藜蘆醇含量及提取量[11]。根據(jù)以下公式計(jì)算白藜蘆醇的提取量：

白藜蘆醇提取量(mg/g)=(C×V)÷M×1 000

稱(chēng)取粉碎過(guò)篩的花生芽粉，記為M，單位為g；試驗(yàn)后提取液稀釋后的體積，記為V，單位為mL；根據(jù)方程得出的白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，記為C，單位為g/mL。

2　結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精確稱(chēng)取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用甲醇稀釋于50mL容量瓶中，搖勻，所得濃度為0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取對(duì)照液1、2、3、4、5、6、7mL，分別置于25mL容量瓶中，用甲醇定容后，然后分別測(cè)其在306nm處的吸光值，平行測(cè)定3次，求平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即A=0.145C+0.011 4，R2=0.999 9。

圖1　白藜蘆醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve of resveratrol content

2.2纖維素酶酶解試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1不同酶解溫度對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，酶的添加量為0.1g、在料液比1∶20(g/mL)、加入60%乙醇，酶解pH5.0(用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)pH值)、酶解時(shí)間2.0h的條件下，分別對(duì)30℃、40℃、50℃、60℃、70℃酶解溫度進(jìn)行提取，并測(cè)其吸光度根據(jù)回歸線(xiàn)性方程并計(jì)算提取量，其結(jié)果見(jiàn)圖2A。

圖2　不同酶解溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)和酶解時(shí)間(D)對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響Fig.2　The effect of reaction temperature (A), add the amount (B), pH (C) and enzymolysis time (D) on extraction of resveratrol in the peanut bud

由圖2A可知，在酶解過(guò)程中，隨著酶解的溫度不斷升高，白藜蘆醇提取量先升高后降低，在50℃時(shí)，白藜蘆醇的含量最高，可達(dá)到2.20mg/g。在酶解反應(yīng)中，反應(yīng)速度因溫度的變化而變化的同時(shí)，同時(shí)也因?yàn)闇囟雀哂诿傅淖罴褱囟榷姑傅幕钚詥适Ш透淖兠傅姆€(wěn)定性，當(dāng)溫度達(dá)到60～70℃，會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高而使酶的活性部分喪失，影響酶與原料的反應(yīng)，從而導(dǎo)致提取量降低。因此，提取白藜蘆醇的酶解溫度以50℃左右為宜。

2.2.2不同酶添加量對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)、加入60%乙醇，調(diào)節(jié)pH值為5.0的條件下，在酶解時(shí)間2.0h條件下，酶解溫度50℃，分別添加酶的量為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25g的酶進(jìn)行提取，其他條件與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖2B。由圖2B可知，白藜蘆醇的提取量在酶添加量為0.05～0.20g范圍內(nèi)隨著酶添加量的升高而升高，但在酶添加量為0.25g時(shí)，白藜蘆醇的含量反而下降，可能是由于花生芽在大量纖維素酶的作用下被酶過(guò)分分解，導(dǎo)致提取花生芽中白藜蘆醇的提取量下降。因此，提取白藜蘆醇的酶添加量以0.2g左右為宜。

2.2.3不同pH值對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)、酶解溫度50℃、酶添加量0.2g、在酶解時(shí)間2.0h條件下，在pH分別為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2下提取，其它與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖2C。由圖2C可知，白藜蘆醇在pH為5.0時(shí)，提取量最高，表明酶在5.0時(shí)活力最好，但是在pH5.0之后白藜蘆醇的提取量隨著pH值的增加呈顯著的下降趨勢(shì)。此試驗(yàn)所用的纖維素酶最適的pH值為4.8，當(dāng)溶液的pH超過(guò)最適pH值范圍(大多數(shù)酶的最適pH值在4.0～8.0范圍內(nèi))，可能導(dǎo)致酶喪失活性，從而影響試驗(yàn)的影響。因此，提取白藜蘆醇的pH值為5.0左右為宜。

2.2.4不同酶解時(shí)間對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)，酶解溫度50℃、酶添加量0.2g，調(diào)節(jié)pH值為5.0的條件下，分別對(duì)1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h的酶解時(shí)間進(jìn)行提取，其他條件與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖2D。由圖2D可知，酶解時(shí)間從1.0～1.5h，白藜蘆醇的提取量呈直線(xiàn)上升，當(dāng)酶解時(shí)間在1.5h時(shí)，白藜蘆醇最提取量最高，但是當(dāng)時(shí)間超過(guò)1.5h，提取量下降，可能由于長(zhǎng)時(shí)間在50℃下，纖維素酶發(fā)生變性而喪失部分活性，并且對(duì)于白藜蘆醇本身不夠穩(wěn)定的性質(zhì)造成影響，導(dǎo)致酶解時(shí)間在1.5h之后，提取量降低的。因此，提取白藜蘆醇的酶解時(shí)間以1.5h左右為宜。

2.2.5纖維素酶酶解的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

研究通過(guò)單因素法試驗(yàn)，確定了酶解溫度(A)、酶添加量(B)、pH(C)、酶解時(shí)間(D)這4個(gè)因素對(duì)提取試驗(yàn)的影響，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定了正交試驗(yàn)的各因素水平，見(jiàn)表1。采用L9(34)正交試驗(yàn)表安排了各試驗(yàn)的因素水平，進(jìn)行試驗(yàn)并且測(cè)定花生芽中白藜蘆醇提取量，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　酶解法提取白藜蘆醇正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1　Enzymatic hydrolysis to extract resveratrol factors orthogonal test level

表2　酶解法提取白藜蘆醇正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2　Enzymatic hydrolysis to extract resveratrol orthogonal experimental results and analysis

表3　酶解法提取白藜蘆醇試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab.3　Enzymatic hydrolysis to extract resveratrol test results of anova table

注：F0.01(2，2)=99，F(xiàn)0.05(2，2)=19，“*”表示顯著(0.01F0.01)

通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)，由表2極差R分析可知，對(duì)提取白藜蘆醇的影響大小主次順序?yàn)椋篊最大，其次分別是A、B、D，即pH值>酶解溫度>酶添加量>酶解時(shí)間，與表3方差分析結(jié)果一致。說(shuō)明pH值是影響白藜蘆醇提取量的主要因素，酸度或者堿度在提取白藜蘆醇的過(guò)程中有很大的影響，在相同的提取條件下可改變白藜蘆醇的提取量，提取過(guò)程適宜的pH值為4.8。酶解溫度和酶添加量是改變白藜蘆醇提取量的次要的2個(gè)因素，當(dāng)pH值為4.8，酶解溫度低于60℃時(shí)，隨著酶解溫度的升高，提取出的白藜蘆醇含量也跟之越高，然而超過(guò)60℃時(shí)，提取出的含量緩慢下降。酶解時(shí)間，是酶解法提取白藜蘆醇中影響最小的因素，酶解可基本上把脂肪和蛋白質(zhì)去除掉，得到白藜蘆醇。因此，確定最佳提取工藝為：A3B2C1D3，即酶解溫度為60℃，酶添加量為0.2g，pH值為4.8，酶解時(shí)間為2.0h，其提取量為2.85mg/g。

2.3超聲波處理試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1不同乙醇濃度對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇濃度，在50℃，頻率為40kHz超聲波水浴中提取30min，其它條件與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖3A。

由圖3A可知，乙醇濃度從40%到70%時(shí)，白藜蘆醇的提取量緩慢上升，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%，白藜蘆醇的提取量最高，但是當(dāng)濃度超過(guò)70%之后，提取量迅速下降，可能是乙醇濃度太高，且花生芽本身含有一些醇溶性和親脂性成分，該成分影響著對(duì)白藜蘆醇的提取，而且白藜蘆醇本身是多羥基結(jié)構(gòu)，容易和乙醇中所含有的水結(jié)合將白藜蘆醇從花生芽中溶解出來(lái)。因此，提取白藜蘆醇的乙醇濃度以70%左右為宜。2.3.2超聲時(shí)間對(duì)花生芽中白藜蘆醇提效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)，加入70%乙醇，溫度50℃下，頻率為40kHz超聲波水浴中分別提取10min、20min、30min、40min、50min，其他條件與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖3B。

圖3　不同乙醇濃度(A)、超聲波時(shí)間(B)、超聲波溫度(C)、料液比(D)對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響Fig.3　The effect of alcohol concentration (A), ultrasonic time(B), ultrasonic temperature (C) and solid-liquid ratio (D) on extraction of resveratrol in the peanut bud

由圖3B可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇提取量先升高后降低，提取40min時(shí)，白藜蘆醇提取量達(dá)到最高；但是在40min以后時(shí)，提取量下降，其可能是超聲波處理溫度不穩(wěn)定導(dǎo)致的；白藜蘆醇本身的穩(wěn)定性較差，所以超聲時(shí)間的越長(zhǎng)提取出的白藜蘆醇含量較少。因此，提取白藜蘆醇的超聲波處理時(shí)間以40min左右為宜。

2.3.3不同超聲波處理溫度對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，在料液比1∶20(g/mL)，加入70%乙醇，在頻率為40kHz超聲波清洗機(jī)中超聲30min，分別在溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下提取，其他與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖3C。

由圖3C可知，當(dāng)溫度在50℃下時(shí)，白藜蘆醇提取量最高，但是當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，隨著溫度達(dá)到最高點(diǎn)之后提取量開(kāi)始降低，這個(gè)結(jié)果由于白藜蘆醇本身的不穩(wěn)定性，在溫度過(guò)高的條件下對(duì)提取量存在很大的影響，并且試驗(yàn)中產(chǎn)生的試驗(yàn)誤差，都會(huì)導(dǎo)致提取量降低。因此，提取白藜蘆醇的超聲波處理溫度以50℃左右為宜。

2.3.4不同料液比(粉:乙醇)對(duì)花生芽中白藜蘆醇提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g花生芽粉5份，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60分別加入70%乙醇，在50℃下，頻率為40kHz超聲波水浴中提取30min，其他條件與2.1.1相同，其結(jié)果見(jiàn)圖3D。

由圖3D可知，當(dāng)料液比從1∶20增加到1∶50，提取量逐漸升高，料液比在1∶50的情況下，白藜蘆醇的提取量最高，但是當(dāng)料液比增加到1∶60之后，提取出的白藜蘆醇含量略微降低，變化不大，此結(jié)果可能在料液比低于1∶50時(shí)，超聲波并沒(méi)有將白藜蘆醇從花生芽中完全提取出來(lái)，當(dāng)料液比在1∶50時(shí)，白藜蘆醇基本提取完全，在試驗(yàn)過(guò)程中，有部分白藜蘆醇?xì)埩粼谒嘀卸鴮?dǎo)致的損失，當(dāng)料液比超過(guò)1∶60，反應(yīng)體系中的原料濃度降低，導(dǎo)致提取量下降。因此，提取白藜蘆醇的料液比以1∶50左右為宜。

2.3.5超聲波處理正交試驗(yàn)

通過(guò)以單因素試驗(yàn)為研究方法，確定了超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)這4個(gè)因素對(duì)提取試驗(yàn)的影響，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定了正交試驗(yàn)的各因素水平，見(jiàn)表4。采用L9(34)正交試驗(yàn)表安排了各試驗(yàn)的因素水平，進(jìn)行試驗(yàn)并且測(cè)定花生芽中白藜蘆醇提取量，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。

表4　超聲波處理提取白藜蘆醇正交試驗(yàn)因素水平表Tab.4　Ultrasonication to extract resveratrol factors orthogonal test level

表5　超聲波處理提取白藜蘆醇正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.5　Ultrasonication to extract resveratrol orthogonal experimental results and analysis

由表5可知，各因素影響提取白藜蘆醇含量的大小順序?yàn)镃>A>B>D，即乙醇濃度>超聲波處理溫度>超聲波處理時(shí)間>料液比，與表6方差分析結(jié)果一致。說(shuō)明乙醇濃度是影響白藜蘆醇提取量的主要因素，根據(jù)相似相溶的原理，乙醇濃度為70%時(shí)，白藜蘆醇的提取效果最好，但是當(dāng)濃度繼續(xù)增加，提取量逐漸下降，部分雜質(zhì)的溶出影響著對(duì)白藜蘆醇的

表6　超聲波處理提取白藜蘆醇試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab.6　Ultrasonication to extract resveratrol test results of anova table

注：F0.01(2，2)=99，F(xiàn)0.05(2，2)=19，“*”表示顯著(0.01F0.01)

提取；超聲波處理溫度和時(shí)間是改變白藜蘆醇提取量的第二重要的2個(gè)因素，溫度太低、時(shí)間太短則不能將白藜蘆醇完全提取出來(lái)，而溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)則白藜蘆醇提純度較低，綜合所述，確定最佳提取工藝為：A3B3C2D1，即超聲波處理溫度為60℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，超聲波處理時(shí)間為50min，其提取量為3.47mg/g。

2.4驗(yàn)證比較試驗(yàn)

3種不同提取方法的提取量比較見(jiàn)表7。由表7可知，酶解-乙醇提取法、超聲波-乙醇提取法、酶解-超聲波提取法比乙醇回流法分別提高約1.7、2.1、4.6倍。

表7　3種不同提取方法的提取量比較Tab.7　To compare the three different extraction methods of extraction yield

3　結(jié)論

利用超聲波法結(jié)合酶解法提取花生芽中白藜蘆醇，最佳提取工藝條件為：超聲波處理溫度為60℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，超聲波處理時(shí)間為50min，酶解溫度為60℃，酶添加量為0.2g，pH值為4.8，酶解時(shí)間為2.0h，在此條件下白藜蘆醇的最大提取量可達(dá)7.39mg/g。該試驗(yàn)表明，花生芽中白藜蘆醇含量豐富，而且白藜蘆醇品質(zhì)也較好，是提取白藜蘆醇的良好原料，科學(xué)家建議每人每日食入適量的白藜蘆醇對(duì)身體有益，我國(guó)人口眾多，因此我國(guó)對(duì)于食用白藜蘆醇的市場(chǎng)需求量是巨大的。因而從花生芽中提取白藜蘆醇具有較大的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization on extracting technology of resveratrol from peanut bud by ultrasonic-assisted enzymatic

TAN Shuqiong,XIE Yongwu

(Minnan Science and Technology Institute, Fujian Normal University， Quanzhou, Fujian 362332, China)

Peanut sprout was used as raw material. Using compound treated with cellulose and ultrasonic, resveratrol extraction from peanut sprout. Moreover, observing the effects on resveratrol extraction rate of reaction, quantity, pH, enzymolysis time and ultrasonic of the factors such as temperature, time, alcohol concentration and solid-liquid ratio for the sample were studied by single. Factor and orthogonal tests, the optimum condition of extraction was obtained. The results show that the optimum extraction process was peanut sprout powder 1.000g, reaction temperature 60℃, enzyme added 0.2g, pH 4.8, enzymolysis time 2.0h, ultrasonic temperature 60℃, alcohol concentration 70%, solid-liquid ratio 1∶40, ultrasonic time 50 min. Under these conditions, best extractive ratio achieved 7.39mg/g. The extractive ratio increases by about 4.6 times than refluent ethanol extraction.

peanut bud; resveratrol; cellulase enzymatic hydrolysis; ultrasonication

1004—5570(2016)04-0068-07

2016-05-08

譚屬瓊(1985-)，女，講師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail:xt102545@163.com.

TQ463

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