□ 蔡佳佳　張　巖　邢春玉　郭　美　李雪瑩　白芯語　天津天獅學院生物與食品工程學院

猴頭菌麥角甾醇高產(chǎn)菌株選育及深層培養(yǎng)條件的優(yōu)化

□ 蔡佳佳張巖邢春玉郭美李雪瑩白芯語天津天獅學院生物與食品工程學院

通過單因素實驗確定猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽；在此基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交實驗方法，確定液態(tài)深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件；采用自然選育和紫外誘變法，篩選出麥角甾醇產(chǎn)量較高的猴頭菌株。結(jié)論表明：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.075%、蛋白胨1%、起始pH值5.0、裝液量80 mL、接種量6 mL，溫度23℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，猴頭菌生長情況良好；紫外線照射40 s的菌株在平板培養(yǎng)基上生長最好，搖瓶發(fā)酵后發(fā)酵液、菌絲球、菌絲粉中麥角甾醇含量分別為：0.062 25 mg/10 mL、9.686 2 mg/g、18.440 3 mg/g，明顯高于對照組。

猴頭菌；麥角甾醇；高產(chǎn)菌株；紫外誘變

猴頭菌又稱猴菜、猴頭菇、對臉蘑[1]，屬于擔子菌亞門猴菇科猴菇屬的大型食用菌、藥用菌[2]，能夠促進血液循環(huán)，抑制腫瘤細胞生長，對胃粘膜有很好的保護作用[3]，其中甾醇類物質(zhì)具有降血脂、預(yù)防心血管疾病、延緩衰老等作用，也是多種激素、維生素D合成的前體[4]，在物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹5]。近年來，我國消費者對麥角甾醇的需求量呈逐年增長趨勢，麥角甾醇高產(chǎn)菌株的選育就顯得尤為重要。

目前，研究還是以猴頭菌子實體居多，但子實體的生產(chǎn)性能不穩(wěn)定，不能保證對原料質(zhì)量穩(wěn)定的要求，而液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)周期短、菌齡一致、菌絲生長速度快、接種簡單、不受季節(jié)的限制可以周年生產(chǎn)，保證了猴頭菌在生產(chǎn)過程中的可控性及目標產(chǎn)物的品質(zhì)穩(wěn)定性。通過對猴頭菌液態(tài)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，篩選出猴頭菌最適深層培養(yǎng)條件[6-9]，為猴頭菌菌絲體高收率的生產(chǎn)提供一條便捷高效的生產(chǎn)途徑，進而滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。

1　材料與方法

1.1菌種

猴頭菌種為天獅學院生物與食品工程學院實驗室保藏菌種。

1.2主要儀器及試劑

恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-2102C型，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204型，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-78A型，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司）；低速離心機（TD5K-III型，長沙東旺實驗儀器有限公司）；精密電子天平（BSA124S型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；生化培養(yǎng)箱（MI-80A型，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；單光束紫外可見分光光度計（UV 1000型，上海天美科學儀器有限公司）。

麥角甾醇標準品100 mg（純度≥98% 上海圻明生物科技有限公司）；馬鈴薯（市售）；葡萄糖、蔗糖（分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；可溶性淀粉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；麥芽浸粉（分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；瓊脂粉（分析純，上海藍季科技發(fā)展有限公司）；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；硫酸鐵銨（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市盛淼精細化工有限公司）；石油醚（分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；95%乙醇（分析純 天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1斜面、平板培養(yǎng)基

馬鈴薯30%（煮汁），蛋白胨0.5%，葡萄糖2%，瓊脂1.3%，pH自然。

1.3.2初篩液體培養(yǎng)基

用2%木屑提取汁溶解：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，pH自然。

1.3.3液體發(fā)酵培養(yǎng)基

單因素實驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，pH自然。

分別選擇碳源：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽浸粉、葡萄糖+可溶性淀粉。氮源：蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏。無機鹽：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳。將上述不同碳源、氮源和無機鹽分別替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂，分別組成不同的碳源、氮源、無機鹽液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4菌種活化、復(fù)壯及初篩

轉(zhuǎn)接保藏的猴頭菌菌種，分別接種于新鮮斜面培養(yǎng)基活化，23℃培養(yǎng)5～7 d。

將活化菌種接種于初篩液體培養(yǎng)基中，23℃、150 rpm下培養(yǎng)6~8 d。取適量猴頭菌培養(yǎng)液，經(jīng)無菌漏斗過濾制備單孢子液。將單孢子液進行梯度稀釋。選取連續(xù)3個稀釋度，將稀釋孢子液0.1 mL分別涂布于平板培養(yǎng)基中，于23℃下培養(yǎng)分離單菌落。經(jīng)分離純化選取菌絲體生長速度快的猴頭菌株，截取邊緣的幼齡菌絲，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，于23℃下培養(yǎng)5 d。

1.5菌株紫外誘變

將初篩菌株，以單因素實驗中的最合適條件搖瓶培養(yǎng)5~7 d后，取20 mL的猴頭菌發(fā)酵液，制備單孢子液。經(jīng)梯度稀釋后，選取連續(xù)3個稀釋度的單孢子液分別倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿，進行紫外線照射。以不經(jīng)紫外線照射的單孢子液作對照，分別于平板培養(yǎng)基中分離單菌落，每組重復(fù)2次。注意避光，黑紙包扎完好，于23℃培養(yǎng)5~7 d。

將紫外誘變后分離的單菌落的邊緣幼齡菌絲，接種至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，接種至單因素實驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵6~8 d，測定麥角甾醇含量。

1.6菌株液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

由單因素實驗確定最適的碳源、氮源、無機鹽，進而對碳源用量、氮源用量及無機鹽用量進行三因素三水平的正交實驗，以菌絲體收率為指標確定猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分的含量。

1.7菌絲體收率的測定

發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾，得猴頭菌菌絲體，80℃干燥8～10 h，稱重。

1.8麥角甾醇的測定

麥角甾醇含量的測定：鐵礬顯色法[10]。565 nm波長下測定吸光度，以麥角甾醇標準品質(zhì)量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

分別測定發(fā)酵液、菌絲體、菌絲粉中麥角甾醇的含量，篩選出麥角甾醇產(chǎn)量較高的菌株。

2　結(jié)果與討論

2.1碳源對猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖1、表1可知，碳源對猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。其中葡萄糖的菌絲體收率為0.445 1 g/100 mL，可以作為液體培養(yǎng)的碳源。

2.2氮源對猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖2、表2可知，氮源對猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。其中酵母膏對菌絲生長的促進作用較大，菌絲體干重為0.399 0 g/100 mL，其次為蛋白胨，所生成的猴頭菌菌絲體的干重為0.214 6 g/100 mL，所以選擇酵母膏和蛋白胨，作為液體培養(yǎng)的氮源。

2.3無機鹽對猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖3、表3可知，無機鹽對猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。液態(tài)深層發(fā)酵時，在以磷酸二氫鉀為無機鹽的培養(yǎng)基中，有明顯的促進作用，菌絲生長速度快、菌絲球小、數(shù)量多、發(fā)酵液顏色澄清；以硫酸鎂、硫酸錳為無機鹽的培養(yǎng)基，菌絲生長不佳，發(fā)酵液的顏色均有混濁且偏深色。故選擇磷酸二氫鉀作為液體培養(yǎng)的無機鹽。

圖1　不同碳源對菌絲體生成量的影響

表1　碳源的單因素實驗方差分析表

圖2　不同氮源對菌絲體生成量的影響

表2　氮源的單因素實驗方差分析表

圖3　不同種類無機鹽對菌絲體生成量的影響

表3　無機鹽的單因素實驗方差分析表

2.4正交試驗極差分析

2.4.1培養(yǎng)基成分正交實驗極差

分析

由表4極差分析得出，葡萄糖用

量是影響菌絲體收率的最大因素，且RA>RB>RC，故各因素的主次順序為A葡萄糖濃度，B酵母膏濃度，C無機鹽濃度。A列因素：K2>K3>K1；B列因素：K2>K3>K1；C列因素：K3>K2>K1。最優(yōu)方案為A2B2C3，即葡萄糖濃度為2%，酵母膏濃度為0.5%，磷酸二氫鉀濃度為0.15%。此結(jié)論與表4中菌絲體干重最高組的實驗結(jié)果相符，即試驗號為“4”的方案為A2B2C3，其菌絲體干重為0.670 3 g/100 mL（正交實驗中最高）。因此確定A2B2C3為最優(yōu)方案。

2.4.2培養(yǎng)條件正交實驗極差分析

由表5培養(yǎng)條件正交實驗極差分析可知，對猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體收率影響最大的培養(yǎng)條件是裝液量，且RB>RA>RC，故各因素的主次順序為B裝液量，A起始PH，C接種量。其中，A列因素：K1>K3>K2；B列因素：K1>K3>K2；C列因素：K1>K3>K2。最優(yōu)方案為A1B1C1，即PH為5.0，裝液量為80 mL，接種量為6 mL，在這個條件下經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)的菌絲體干重最大，測定結(jié)果為0.688 9 g/100 mL。此結(jié)論與表5中試驗號為“1”的培養(yǎng)條件下的菌絲體干重測定值相對應(yīng)，即方案A1B1C1的菌絲體干重結(jié)果最高（為0.688 9 g/100 mL），符合正交實驗極差分析結(jié)果。

2.5正交試驗方差分析

2.5.1培養(yǎng)基成分正交實驗方差分析

在方差分析中，因各實驗條件下無重復(fù)，故以最小平方和列作為誤差列，在a=0.05的情況下，進行F檢驗。本正交實驗的方差分析中，以無機鹽濃度偏差平方和作為誤差，方差分析結(jié)果列于表6。

由表6可知，葡萄糖以及酵母膏對于猴頭菌菌絲體生成的影響是顯著的，其中葡萄糖的影響是特別顯著的，而無機鹽對其影響則不顯著。結(jié)合正交實驗極差分析結(jié)果，表明猴頭菌菌絲體生成主要取決于液態(tài)培養(yǎng)基中的碳源和氮源。

2.5.2培養(yǎng)條件正交實驗方差分析

在方差分析中，因各實驗條件下無重復(fù)，故以最小平方和列作為誤差列，在a=0.05的情況下，進行F檢驗。本正交實驗的方差分析中，以接種量偏差平方和作為誤差，方差分析結(jié)果列于表7。

由表7可知，初始PH、裝液量及接種量對于猴頭菌菌絲體生成的影響均為顯著，其中裝液量的影響是特別顯著的。結(jié)合正交實驗極差分析結(jié)果，表明猴頭菌菌絲體生成與培養(yǎng)條件的關(guān)系較為密切，包括初始PH、裝液量及接種量。

表4　培養(yǎng)基成分正交實驗極差分析

表6　培養(yǎng)基成分正交實驗方差分析

表7　培養(yǎng)條件正交實驗方差分析

2.6正交實驗驗證實驗

2.6.1培養(yǎng)基成分正交實驗驗證實驗

將正交得出的最優(yōu)方案組合A2B2C3進行驗證，得出結(jié)果見表8。經(jīng)驗證實驗，A2B2C3試驗中猴頭菌菌絲體干重的平均值為0.616 1 g/100 mL，故確定培養(yǎng)基成分的最優(yōu)方案為A2B2C3。

2.6.2培養(yǎng)條件正交實驗驗證實驗

將正交得出的最優(yōu)方案組合A1B1C1進行驗證，得出結(jié)果見表9。

經(jīng)驗證實驗，A1B1C1試驗中猴頭菌菌絲體干重的平均值為0.662 4 g/100 mL，故確定培養(yǎng)條件的優(yōu)方案為A1B1C1。

2.7紫外誘變菌體生長情況

每天定時觀察平板培養(yǎng)基上的菌絲，記錄其生長顏色、長勢、邊緣整齊度等情況，并對比，用“*”號表示菌絲生長普通、較一般，“**”號表示菌絲長勢良好，“***”號表示菌絲生長最密、生長最好。記錄情況見表10。

照射40、50、60 s的實驗組，與對照組相比均有明顯差異，均好于對照組，且照射40 s的實驗組情況最理想：色澤度好、菌體生長整齊、單菌落面積最大。

2.8麥角甾醇含量測定

麥角甾醇標準曲線圖，如圖4所示。

由標準曲線方程y=1.202 1x-0.004 5，測定猴頭菌不同樣品中麥角甾醇的含量。樣品為經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)后所得猴頭菌菌絲粉（水分為8.8%）、濕重菌絲球和猴頭菌發(fā)酵液，結(jié)果見表11。

由表11可知，將各樣品稀釋液的吸光度A代入麥角甾醇質(zhì)量曲線方程，再根據(jù)含量計算公式，得出菌絲粉中麥角甾醇含量為27.67 mg/g，濕重菌絲球中麥角甾醇含量為24.22 mg/g，發(fā)酵液中麥角甾醇含量為0.62 mg/100 mL。

表8　培養(yǎng)基成分正交實驗驗證實驗

表9　培養(yǎng)條件正交實驗驗證實驗

表10　菌體的生長狀況

圖4　麥角甾醇標準曲線圖

表11　不同樣品中麥角甾醇的含量

3　結(jié)論

對于猴頭菌液態(tài)深層發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)條件和篩選麥角甾醇高產(chǎn)菌株，通過各項實驗數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論。

（1）綜合單因素實驗和正交實驗結(jié)果，得出最適猴頭菌液態(tài)深層培養(yǎng)條件為：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，蛋白胨1%，在PH5.0、裝液量80 mL、接種量6 mL情況下，如果菌種活性良好，于23℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，猴頭菌菌絲體收率可達0.622 5 g/100 mL。

（2）誘變實驗：比較經(jīng)過不同時間的紫外照射后菌落的色澤、面積大小等總體生長狀況，發(fā)現(xiàn)照射40 s＞60 s＞50 s＞對照組；且實驗組紫外線照射后，發(fā)酵液、菌絲球、菌絲粉中麥角甾醇含量都比對照組高?？梢娫诔鹾Y的基礎(chǔ)上，結(jié)合紫外誘變獲得的菌株，其在固體培養(yǎng)基上的生長時間縮短，且菌絲體中麥角甾醇含量有所提高。相信經(jīng)過連續(xù)適當?shù)恼T變處理，獲得猴頭菌的麥角甾醇高產(chǎn)的誘變菌株，可以作為生產(chǎn)菌種，能縮短工業(yè)化生產(chǎn)菌絲體的周期，提高生物產(chǎn)量。

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天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201510859004）。