李卓成，張彥鵬，吳偉清，李延武，丁芳林

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　518000)

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鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株外排泵分布水平與碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素耐藥研究*

李卓成，張彥鵬，吳偉清，李延武，丁芳林

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科518000)

目的研究鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株中外排泵分布水平與碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素耐藥相關(guān)情況。方法選擇2015～2016年度深圳地區(qū)臨床分離的182株鮑曼不動(dòng)桿菌，同時(shí)進(jìn)行外排泵抑制試驗(yàn)和肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果按照藥敏和外排泵表型兩種因素分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果鮑曼不動(dòng)桿菌182株臨床分離株中，外排泵表型陽(yáng)性54株(29.7%)；結(jié)合碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素藥敏分組統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性組中耐藥和敏感分別為31.9%和13.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.46，P<0.05)。結(jié)論鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵耐藥機(jī)制在臨床分離株的碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素耐藥中起作用。

鮑曼不動(dòng)桿菌；外排泵；耐藥

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類(lèi)重要的革蘭染色陰性的非發(fā)酵醫(yī)院內(nèi)感染病原菌，常引起醫(yī)院內(nèi)免疫功能低下患者嚴(yán)重的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、手術(shù)傷口部位感染、泌尿道感染、血流感染及繼發(fā)性腦膜炎等[1]。隨著近年來(lái)廣譜抗生素普遍使用等原因，臨床上鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥株和泛耐藥株在世界范圍內(nèi)不斷涌現(xiàn)[2]。碳青霉烯類(lèi)抗生素是目前臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染最有效的抗菌藥物之一[3]。常見(jiàn)的有亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEO)等，能夠抵抗大多數(shù)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和AmpC的水解。近年來(lái)，耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥比例也逐年增高,而其耐藥一旦突破碳青霉烯類(lèi),人類(lèi)將面臨無(wú)藥可選的窘境[4]。鮑曼不動(dòng)桿菌針對(duì)碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素的耐藥機(jī)制主要有4類(lèi)：(1)表達(dá)碳?xì)涿赶┟?。主要是Ambler分類(lèi)中的D類(lèi)酶，即苯唑西林酶(OXA)，包括OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58[5]。(2)產(chǎn)生構(gòu)象改變的青霉素結(jié)合蛋白降低碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素的結(jié)合量。(3)下調(diào)外膜通道蛋白的表達(dá)或缺如，如Car類(lèi)、OPM類(lèi)，從而減少抗生素進(jìn)入細(xì)菌[5]。(4)多種外排泵基因的過(guò)量表達(dá)，將進(jìn)入細(xì)菌的抗生素主動(dòng)排出。鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵主要有5大家族，其中最重要的為RND家族，包括均由3部分構(gòu)成的AdeABC、AdeFGH和AdeIJK等外排泵[6]。細(xì)菌外排泵對(duì)藥物的外排作用是主動(dòng)耗能過(guò)程,其能力源于質(zhì)子的濃度梯度，而羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide-m-chlorophenyl hydrazone，CCCP)可以抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)劑,通過(guò)破壞質(zhì)子濃度梯度,抑制主動(dòng)外排系統(tǒng)的外排作用[7]。本研究擬使用CCCP作為泵抑制劑，研究鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株外排泵的分布水平，并分析外排泵表型與碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1菌株來(lái)源2015～2016年分離自深圳市第二人民醫(yī)院的182株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株。細(xì)菌分離培養(yǎng)按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行》進(jìn)行[8]，所有菌株均經(jīng)過(guò)鑒定，剔除分離自同一患者相同部位標(biāo)本的重復(fù)菌株。

1.2儀器與試劑全自動(dòng)微生物分析儀(VITEK-2 COMPACT)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；泵抑制劑CCCP來(lái)源于Sigma公司；MH平板和MH肉湯來(lái)源于鄭州貝瑞特公司，無(wú)菌聚苯乙烯96孔板來(lái)源于美國(guó)CORNING公司；IPM標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，IPM溶劑選擇pH8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS),濃度為1 280 μg/mL,分裝后貯存于-70 ℃保存?zhèn)溆?；恒溫振蕩培養(yǎng)箱為太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.3質(zhì)控菌株鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978，大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923。質(zhì)控菌株源于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.4鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵抑制實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇凍存于-70 ℃超低溫冰箱的菌株，接種于MH平板37 ℃培養(yǎng)10～16 h后，選擇鮑曼不動(dòng)桿菌典型單菌落接種于MH肉湯培養(yǎng)基；37 ℃ 180 r/min恒溫振蕩過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h后，配置菌液濃度0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，用MH肉湯1∶1 000稀釋后每孔中100 μL接種以下2種96孔板。(1)泵抑制實(shí)驗(yàn)板：各孔含終濃度10 μg/mL的CCCP，且每行第1～12孔從左到右含終濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL的IPM，每行最后1孔均為僅含相同濃度CCCP的MH肉湯做生長(zhǎng)對(duì)照孔；(2)最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定板：不含CCCP，且每行各孔從左到右含終濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL的IPM；將各96孔板置于37 ℃普通空氣孵箱中,孵育16～20 h判斷結(jié)果[9]。

1.5結(jié)果判斷各菌株MIC結(jié)果判讀按2010 版美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI) 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，且96孔板相應(yīng)最后一列生長(zhǎng)對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)外排泵抑制實(shí)驗(yàn)才成立[9]。如微量肉湯稀釋法測(cè)定各菌株MIC值出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象,則選擇抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的較高藥物濃度為其MIC值。如出現(xiàn)多處跳孔,則需重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。各菌株外排泵陽(yáng)性表型的判斷標(biāo)準(zhǔn)：存在泵抑制劑CCCP時(shí)的菌株MIC測(cè)定結(jié)果比不存在CCCP的MIC值下降4倍及以上。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株的科室分布鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株共計(jì)182株，其中重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)病區(qū)分離株最多，共78株(42.8%)；呼吸內(nèi)科和神經(jīng)外科的分離株也均超過(guò)10%(分別為15.3%和13.4%)。見(jiàn)表1。

表1　182株鮑曼不動(dòng)桿菌的科室分布

2.2鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果將鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株按標(biāo)本類(lèi)型可分為痰液(48.2%)、肺泡灌洗液(8.9%)、分泌物(10.7%)、尿液(14.3%)、血液(7.1%)和其他(10.7%)。182株鮑曼不動(dòng)桿菌中，根據(jù)肉湯稀釋法測(cè)定各菌株MIC結(jié)果，其中IPM敏感(S)36株(19.8%)，中介(I)31株(17.0%)，耐藥(R)116株(63.7%)。182株鮑曼不動(dòng)桿菌中外排泵表型陽(yáng)性54株(29.7%)，外排泵陰性表型128株(70.3%)。陽(yáng)性組中S與R比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.46，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　182株鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵表型與耐藥表型分布

3　討　　論

鮑曼不動(dòng)桿菌為條件致病的革蘭陰性非發(fā)酵菌。臨床分離株多源于ICU病房、呼吸科、神經(jīng)外科、康復(fù)科等病區(qū)的痰液、肺泡灌洗液、分泌物等組織標(biāo)本。該菌可在住院患者及醫(yī)院環(huán)境中定植，且抗逆性強(qiáng)，是醫(yī)院感染最常見(jiàn)的致病菌[10]。長(zhǎng)期廣譜抗生素的使用對(duì)菌株產(chǎn)生持續(xù)的抗生素選擇壓力，造成該菌耐藥性逐年提高，多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不斷產(chǎn)生[11]。全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)(2014年)顯示該菌對(duì)于青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥水平均超過(guò)60%[12]；鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥，甚至泛耐藥菌株的出現(xiàn)，成為醫(yī)院感染控制和臨床治療的重大威脅，被喻為革蘭陰性菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)”[7]。本研究所用的182株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素IPM耐藥率為63.7%，且有17%為中介，對(duì)其敏感的菌株僅占19.8%，菌株耐藥控制的境況不容樂(lè)觀。

藥物外排泵機(jī)制是鮑曼不動(dòng)桿菌重要的耐藥機(jī)制，迄今為止已發(fā)現(xiàn)20余種外排泵[12]，可以大致分為5大外排泵家族，其中最重要的為RND家族，包括均由3個(gè)蛋白質(zhì)部分構(gòu)成的AdeABC、AdeFGH和AdeIJK等外排泵[13]。這些外排泵多為能量依賴(lài)型外排泵，利用質(zhì)子或Na+離子偶聯(lián)交換提供動(dòng)力，能夠?qū)⒍喾N抗生素、金屬離子、表面活性劑和多種消毒劑排出細(xì)胞外[14]。2013年西班牙學(xué)者 Rumbo等[4]研究了鮑曼不動(dòng)桿菌5大外排泵家族近20種外排泵在臨床菌株中的大致分布情況，以及外排泵機(jī)制對(duì)于菌株耐藥水平影響；有研究發(fā)現(xiàn)主動(dòng)外排泵機(jī)制是細(xì)菌抵御外界抗生素壓力等不良環(huán)境和因素的重要手段，成為細(xì)菌獲得性多重耐藥的重要原因[7，15]。

本研究中,臨床分離的182株鮑曼不動(dòng)桿菌中,約有54株(29.7%)有外排泵機(jī)制，陽(yáng)性組中S與R比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.46，P<0.05)。提示鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵的耐藥機(jī)制在本研究臨床分離株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制中起作用，通過(guò)抑制外排泵的對(duì)碳?xì)涿赶╊?lèi)抗生素主動(dòng)泵出，提高了菌體內(nèi)抗生素有效水平從而降低了MIC值?？梢哉J(rèn)為，較低的毒副作用和較高外排抑制活性，成為開(kāi)發(fā)前景良好的外排泵抑制劑類(lèi)新型抗生素的必要條件。

[1]王輝,郭萍,孫宏莉,等.碳青霉烯類(lèi)耐藥的不動(dòng)桿菌分子流行病學(xué)及其泛耐藥的分子機(jī)制[J].中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(12):1066-1073.

[2]Jia W,Li C,Zhang H,et al.Prevalence of Genes of OXA-23 Carbapenemase and AdeABC Efflux Pump Associated with Multidrug Resistance of Acinetobacter baumannii Isolates in the ICU of a Comprehensive Hospital of Northwestern China[J].Int J Environ Res Public Health,2015,12(8):10079-10092.

[3]朱德妹，汪復(fù)，胡付品,等.2010年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2011,11(5):321-329.

[4]Rumbo C,Gate E,López M,et al.Contribution of efflux pumps,porins,and beta-lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(11):5247-5257.

[5]沈繼錄，朱德妹，吳衛(wèi)紅,等.革蘭陰性桿菌碳青霉烯酶產(chǎn)生與細(xì)菌耐藥性關(guān)系的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,31(4):408-414.

[6]侯天文,尹曉琳,李瑋,等.多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)耐藥基因檢測(cè)分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2007,27(4):379-383.

[7]Yoon EJ,Courvalin P,Grillot-Courvalin C.RND-type efflux pumps in multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii:major role for AdeABC overexpression and AdeRS mutations[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(7):2989-2995.

[8]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006.

[9]Richmond GE,Chua KL,Piddock LJ.Efflux in Acinetobacter baumannii can be determined by measuring accumulation of H33342 (bis-benzamide)[J].J Antimicrob Chemother,2013,68(7):1594-1600.

[10]王輝,劉穎梅,陳民鈞,等.鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥機(jī)制的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2003,25(5):567-571.

[11]Hornsey M,Loman N,Warcham DW,et al.Whole-genome comparison of two Acinetobacter baumannii isolates from a single patient,where resistance developed during tigecycline therapy[J].J Antimicrob Chemother,2011,66(7):1499-1503.

[12]Coldham NG,Webber M,Woodward MJ,et al.A 96-well plate fluorescence assay for assessment of cellular permeability and active efflux in Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(8):1655-1663.

[13]Tiwari V,Tiwari M.Quantitative proteomics to study carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii[J].Front Microbiol,2014,5:512.

[14]Hornsey M,Ellington MJ,Doumith M,et al.AdeABC-mediated efflux and tigecycline MICs for epidemic clones of Acinetobacter baumannii[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(8):1589-1593.

[15]Seifert H,Dolzani L,Bressan R,et al.Standardization and interlaboratory reproducibility assessment of pulsed-field gel electrophoresis-generated fingerprints of Acinetobacter baumannii[J].J Clin Microbiol,2005,43(9):4328-4335.

Study on the distribution of efflux pump and the antibiotic resistance of carbapenems in clinical isolates of Acinetobacter Bauman*

Li Zhuocheng,Zhang Yanpeng，Wu Weiqing，Li Yanwu ，Ding Fanglin

(Department of Clinical Laboratory,the Second People′s Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong 518000,China)

ObjectiveTo study the distribution of efflux pump and the antibiotic resistance of carbapenems in clinical isolates of 182 strains of Bauman Acinetobacter,and to understand the correlation between distribution of efflux pump and the drug resistance of hydrocarbon.MethodsTotally 182 clinical isolates of Acinetobacter Baumannii were selected to detect the efffux phenotype,which were separated between 2015 to 2016 isolated from Shenzhen district,Guangdong province.Efflux pump inhibition test and broth dilution method drug sensitivity test were used.According to the results of the drug sensitivity and the phenotype of efflux pump,Acinetobacter Baumannii were divided into groups(carbapenems resistance group,carbapenems sensitive group,efflux pump positive group and efflux pump negative group),then the results were made statistically analysis.ResultsIn all the 182 isolates,there were 54 strains with positive efflux pump phenotype,and the positive rate was 29.7%.And the efflux phenotype positive rate was 31.9% in carbapenems resistance group,comparing to 13.9% positive rate in carbapenems sensitive group(χ2=4.46,P<0.05).ConclusionThe efflux pumps paly an important role in the resistant mechanism of Acinetobacter Baumannii clinical isolates to carbapenems.

acinetobacter baumannii；efflux pump;resistance

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)“知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃”項(xiàng)目(JCYJ20140414170821183)。作者簡(jiǎn)介：李卓成(1959-)，主任技師，碩士，主要從事臨床微生物與免疫研究。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.012

R378

A

1671-8348(2016)22-3057-03

2016-02-21

2016-04-09)