高曉峰，呂　享，吳彥秋，王汪中，黃圖成，韋紅邊，劉貴賢，張明生

(貴州大學 生命科學學院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

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杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育中內(nèi)源激素的含量變化

高曉峰，呂享，吳彥秋，王汪中，黃圖成，韋紅邊，劉貴賢，張明生

(貴州大學 生命科學學院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

采用ELISA法測定了杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中早期新老假鱗莖的4種內(nèi)源激素(IAA、CTK、GA3和ABA)含量的動態(tài)變化。結果表明：在杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中新老假鱗莖內(nèi)源激素含量及比例呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。新老假鱗莖中IAA含量變化較為復雜，一年生假鱗莖呈先急劇下降后上升再小幅下降的變化，二年生假鱗莖表現(xiàn)出兩個峰頂和三個峰谷的變化，三年生假鱗莖則呈先升后降再升再降的變化；CTK含量的變化是一年生假鱗莖呈先急劇下降后小幅上升再下降，二年生和三年生假鱗莖均呈雙峰曲線；GA3含量變化表現(xiàn)出一年生假鱗莖先升后降再升再降最后急劇上升，二年生假鱗莖先升后降再升，三年生假鱗莖先降后升再降再升的變化趨勢；ABA含量整體呈先升后降的變化；IAA/CTK和IAA/ABA比值的變化幾乎都是先下降后呈雙峰曲線。

杜鵑蘭；假鱗莖；內(nèi)源激素；發(fā)育

杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)為蘭科杜鵑蘭屬的珍稀藥用植物，其干燥假鱗莖為中藥山慈菇的主要來源之一，有清熱解毒、潤肺止咳、活血止痛、消腫散結等功效，內(nèi)用可抗肝癌、乳腺癌、子宮癌等，外用于治瘡毒、蛇蟲咬傷、皮膚燙傷或燒傷等[1]，是常用的重要中藥材，收載于《中國藥典》[2]。然而，因其獨特的繁殖特性[3-5]和對生境的苛刻要求，野生資源瀕臨枯竭。目前為止，研究者從杜鵑蘭的繁殖技術[3-8]、生長發(fā)育[9]、種群數(shù)量與遺傳漂變[10]、化學成分[11-23]、藥理作用[16,24-28]、共生真菌[29-30]及人工栽培[31]等方面作了一定的探索性工作，也取得了一些成果。因杜鵑蘭幾乎不能進行有性繁殖，主要以假鱗莖進行營養(yǎng)繁殖，而串聯(lián)的假鱗莖中每年只有新生的一個假鱗莖能出芽成苗形成一個新的植株，其它假鱗莖均不能再生植株，推測該現(xiàn)象很可能是由其內(nèi)源激素調(diào)控所致，而有關杜鵑蘭內(nèi)源激素方面的研究未見報道。本實驗通過分析杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中新老假鱗莖內(nèi)源激素含量的變化，以期為進一步探索杜鵑蘭假鱗莖出芽成苗的激素調(diào)控機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don) Makino)采自貴陽花溪高坡鄉(xiāng)，以無損傷、無病蟲害的杜鵑蘭新老假鱗莖為實驗材料。

1.2實驗方法

實驗自2014年3月10日開始至2014年9月20日完成。期間每月10日、20日和30日分別取樣，每次取生長時期一致的3株杜鵑蘭假鱗莖(每株須有3個假鱗莖)，剝?nèi)ト~(鞘)片，液氮速凍后立即置于-80℃的冰箱中固定保存，用于內(nèi)源激素含量的測定。

內(nèi)源激素提?。悍Q取1.0 g速凍后的假鱗莖，加2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉入10 mL試管，再用2 mL提取液分次沖洗研缽，洗液一并轉入試管，搖勻，置4℃冰箱內(nèi)提取4 h，3500 r/min離心8 min，取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻，置4℃下再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積，棄去殘渣。上清液過C-18固相萃取柱，將過柱后的樣品轉入10 mL塑料離心管中，真空濃縮干燥，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容[32]。

內(nèi)源激素測定：采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定杜鵑蘭假鱗莖中生長素(IAA)、細胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)的含量。所有內(nèi)源激素的含量均在鮮重條件下測定。試劑盒和測定方法由北京誠林生物科技有限公司提供。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2　結果與分析

2.1杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育過程中IAA含量的變化

杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中，新老假鱗莖內(nèi)IAA含量變化較復雜。在葉芽休眠期內(nèi)，一年生假鱗莖IAA含量由最大值1548.70 ng/g急劇下降到最小值1011.26 ng/g，二年生假鱗莖IAA含量也下降到最低值1089.17 ng/g，而三年生假鱗莖IAA含量卻由1014.99 ng/g上升至1057.33 ng/g。由圖1-a可以看出，在葉芽萌動前，一年生假鱗莖中IAA含量最低，這與其他研究發(fā)現(xiàn)低濃度的IAA能夠促進芽的萌發(fā)的觀點相符。葉芽萌動后至葉芽與根狀莖伸長生長期，IAA含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，二年生和三年生假鱗莖分別達到最大值1560.45 ng/g和1420.89 ng/g，這可能是葉芽頂端產(chǎn)生的生長素向下運輸?shù)慕Y果；隨著新生假鱗莖的初始形成及分化膨大，新老假鱗莖的IAA含量均呈下降趨勢，接著假鱗莖膨大至發(fā)育成熟，一年生和三年生假鱗莖IAA含量基本保持不變，二年生假鱗莖IAA含量呈先下降后上升的趨勢，這樣的變化趨勢可能是因為新生假鱗的形成導致的，頂端產(chǎn)生的生長素基本都用于新生假鱗莖的生長發(fā)育，而很少運輸?shù)皆缙诘募禀[莖中。

a

b

c

d

Fig.1The contents of endogenous hormones in new and old pseudobulbs

A-B. 葉芽休眠期；C. 葉芽萌動期；D-F. 葉芽與根狀莖伸長生長期；G. 假鱗莖初始形成期；H. 假鱗莖膨大期； I. 假鱗莖充分發(fā)育期

2.2杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育過程中CTK含量的變化

新老假鱗莖中CTK含量在新生假鱗莖整個發(fā)育過程中的變化趨勢見圖1-b。在葉芽休眠期內(nèi)，一、二年生假鱗莖中CTK含量呈明顯上升趨勢，且分別達到一個峰值186.09 ng/g和111.64 ng/g，而三年生假鱗莖中CTK含量則從最大值260.09 ng/g急劇下降至132.05 ng/g，即在葉芽萌動前，一年生假鱗積累大量的CTK，為其分化出芽做準備。在葉芽與根狀莖伸長生長期內(nèi)，二年生和三年生假鱗莖中CTK含量呈先升后降的變化趨勢，而一年生假鱗莖中CTK含量呈先降后升的變化，這可能是新老假鱗莖中CTK相互傳遞運輸?shù)慕Y果；至假鱗莖初始形成期和膨大期，新老假鱗莖的CTK含量均顯著下降至最低值，一年生、二年生和三年生假鱗莖CTK含量分別為27.58 ng/g、35.20 ng/g和33.75 ng/g，這是因為該時期是新生假鱗莖生長發(fā)育最快的時期，需要大量的CTK，早期的新老假鱗莖中的CTK向新生假鱗莖中轉移，以滿足新生假鱗莖的生長發(fā)育所需；隨著假鱗莖充分發(fā)育成熟，新老假鱗莖CTK含量有小幅上升趨勢。

2.3杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育過程中GA3含量的變化

杜鵑蘭新老假鱗莖中GA3含量在新生假鱗莖整個發(fā)育過程也表現(xiàn)出較為復雜的變化(圖1-c)。在葉芽休眠期內(nèi)，新老假鱗莖GA3含量均小幅下降，而該時期ABA含量上升(圖1-d)，這與葉芽的休眠息息相關；葉芽萌動前，一年生假鱗莖的GA3含量急劇上升至最大值(0.048 ng/g)，二年生和三年生假鱗莖變化不大，這說明GA3能解除葉芽的休眠，促進葉芽萌發(fā)；葉芽萌發(fā)后，一年生假鱗莖GA3含量迅速下降，二年生和三年生假鱗莖GA3含量均呈上升趨勢，這可能是一年生假鱗莖中的GA3運輸至二年生和三年生假鱗莖中所致；葉芽與根狀莖伸長生長期，新老假鱗莖GA3含量的變化趨勢均不同，一年生假鱗莖上升，二年生假鱗莖下降，三年生假鱗莖呈先升后降趨勢，該時期一年生假鱗莖GA3含量最高，此時正是新生假鱗莖初始形成前的根分化期，說明高濃度的GA3能促進根的分化形成；隨著新生假鱗莖的初始形成，新老假鱗莖的GA3含量明顯下降，一年生和二年生假鱗莖均下降至最低值(分別為0.018 ng/g和0.013 ng/g)，這可能是因為該時期根狀莖伸長生長停止，導致GA3含量的下降；至假鱗莖膨大與充分發(fā)育期，GA3含量又明顯上升，二年生假鱗莖在充分發(fā)育期達最大值(0.057 ng/g)，三年生假鱗莖在膨大期達最大值(0.052 ng/g)，因為這兩個時期是杜鵑蘭新生假鱗莖生長發(fā)育最快的時期，也是杜鵑蘭植株生長最旺盛的時期，高濃度的GA3正好促進細胞和植株的伸長生長。

2.4杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育過程中ABA含量的變化

在杜鵑蘭新生假鱗莖形態(tài)發(fā)生過程中，除葉芽休眠期外，新老假鱗莖的ABA含量均呈顯著下降趨勢(圖1-d)。在葉芽休眠期，新老假鱗莖中ABA含量有小幅上升，一年生、二年生和三年生假鱗莖均達到最大值，分別為639.95 ng/g、617.78 ng/g和613.54 ng/g，這是因為ABA是有促進休眠的作用；隨著葉芽的萌動，新老假鱗莖中ABA含量急劇下降，且一年生假鱗莖下降最快，葉芽萌動前一年生假鱗莖中ABA含量最低，這也說明一年生假鱗莖解除休眠最快；在新生假鱗莖的膨大期，一年生和二年生假鱗莖ABA含量降至最小值，分別為106.50 ng/g和89.16 ng/g，三年生假鱗莖至假鱗莖充分發(fā)育期降至最低值(88.03 ng/g)，這是因為這兩個時期是杜鵑蘭新生假鱗莖及植株生長發(fā)育最旺盛的時期，故促進生長發(fā)育的內(nèi)源激素占優(yōu)勢，ABA減少。

2.5杜鵑蘭假鱗莖發(fā)育過程中激素比例的變化

在杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中，新老假鱗莖內(nèi)IAA/CTK和IAA/ABA的比值呈現(xiàn)規(guī)律性的變化(圖2)。在葉芽休眠期內(nèi)，一年生和二年生假鱗莖內(nèi)IAA/CTK比值呈現(xiàn)下降趨勢，三年生假鱗莖IAA/CTK比值呈上升趨勢，IAA/ABA比值在新老假鱗莖中均呈現(xiàn)下降趨勢；葉芽萌動前，新老假鱗莖內(nèi)IAA/CTK和IAA/ABA的比值均為最低值。植物生長發(fā)育過程中，低IAA/CTK比值有助于芽的萌發(fā)，高IAA/CTK比值促進生根。到葉芽與根狀莖伸長生長期，新老假鱗莖內(nèi)IAA/CTK和IAA/ABA比值的變化較為復雜，呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，在新生假鱗莖初始形成前，也就是在根分化期，IAA/CTK比值相對較高，說明高IAA/CTK比值有利于根的分化；隨著假鱗莖的初始形成至假鱗莖膨大期長成幼苗，新老假鱗莖內(nèi)的IAA/CTK和IAA/ABA的比值急劇上升，說明IAA/CTK和IAA/ABA的高比值有利于幼苗的生長；到假鱗莖充分發(fā)育期，一年生和三年生假鱗莖IAA/CTK的比值下降幅度較大，二年生假鱗莖IAA/CTK的比值仍呈上升趨勢，而新老假鱗莖IAA/ABA的比值變化不大。

3　討論

在植物生長發(fā)育過程中，任何一種生理效應都不是單一激素的作用，而是各種激素相互作用的結果[33]。本研究顯示，葉芽萌發(fā)前，新老假鱗莖中，一年生假鱗莖IAA含量降到最低，CTK含量大于二年生和三年生假鱗莖，ABA含量下降最快，GA3含量急劇上升，IAA/CTK和IAA/ABA的比值降到最低，這一系列的變化都在為一年生假鱗的出芽萌發(fā)做準備，表明杜鵑蘭新生假鱗莖的葉芽萌發(fā)過程受IAA、CTK、ABA和GA34種內(nèi)源激素含量及其比值的綜合調(diào)控。葉芽萌發(fā)后，新生假鱗莖發(fā)育各時期，新老假鱗莖的內(nèi)源激素含量同樣呈規(guī)律性的變化，整個發(fā)育時期受各內(nèi)源激素的共同調(diào)控。

圖2　杜鵑蘭新老假鱗莖內(nèi)源激素含量比例的變化

A-B. 葉芽休眠期；C. 葉芽萌動期；D-F. 葉芽與根狀莖伸長生長期；G. 假鱗莖初始形成期；H. 假鱗莖膨大期； I. 假鱗莖充分發(fā)育期

Brunner[34]和Weigel等人[35]認為，高濃度的IAA有利于形成根原基和不定根。本研究中，新生假鱗莖初始形成前，IAA含量最高，而該時期正是根分化形成的主要時期。CTK的主要生理作用是促進細胞分裂、抑制細胞伸長、促進細胞擴展，且一般認為細胞體積的增大和數(shù)量的增加是依靠CTK含量增加的。但在本研究中，假鱗莖膨大期和充分發(fā)育期，CTK含量卻呈下降趨勢，這可能是因為早期新老假鱗莖中CTK轉移到了新形成的假鱗莖中，以滿足新生假鱗莖生長發(fā)育的需要。

GA3的典型生理作用就是促進植物莖節(jié)的伸長生長，同時在許多植物中內(nèi)源激素GA3與休眠相關，休眠解除過程中，GA3含量變化與ABA相反，呈上升趨勢。如蕓苔屬種子GA3含量迅速增加[36]，百合鱗莖GA3也同樣呈增加趨勢[37]，歐洲甜櫻桃花芽和草莓GA3含量都是先降后升[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)在葉芽萌發(fā)前后，GA3含量也呈先降后升的變化趨勢，在葉芽與根狀莖伸長生長期，呈顯著上升，與大多數(shù)植物GA3含量變化相似；在假鱗莖初始形成期，根狀莖伸長生長停止，根分化形成，GA3含量下降到最低，說明低濃度的GA3對根的分化可能有促進作用。

在許多植物的研究中，內(nèi)源激素ABA促進植物器官休眠、抑制發(fā)芽的觀點已達成共識。如朝鮮冷杉種子層積處理后ABA含量降低以促進發(fā)芽[40]，在休眠解除的過程中，蕓苔屬種子ABA含量急劇下降[36]，百合鱗莖ABA含量也呈下降趨勢[37]，草莓ABA含量呈先升后降的變化趨勢[38]，歐洲甜櫻桃花芽ABA含量與草莓相似，也是先升后降[39]?？傊鄶?shù)植物都是隨著ABA含量的下降，器官休眠解除。本研究結果也表明，在葉芽休眠期，杜鵑蘭新老假鱗莖ABA含量上升；隨著葉芽的萌動，ABA含量顯著下降；在假鱗莖初始形成期至膨大期，ABA含量急劇下降至最低值。

本研究的結果初步反映了在杜鵑蘭新生假鱗莖發(fā)育過程中新老假鱗莖內(nèi)源激素含量變化的一定規(guī)律。可否通過不同生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控杜鵑蘭新老假鱗莖的激素平衡，實現(xiàn)其假鱗莖串中新老假鱗莖均出芽成苗，從而有效提高其繁殖系數(shù)，值得進一步深入探索。

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Endogenous Hormone Content Changes During NewbornCremastraPseudobulb Development

GAOXiao-feng，LVXiang，WUYan-qiu，WANGWang-zhong，HUANGTu-cheng，WEIHong-bian，LIUGui-xian，ZHANGMing-sheng*

(SchoolofLifeSciences，KeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation)，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

The dynamic content changes of four endogenous hormones (IAA，CTK，GA3 and ABA) of the new and old pseudobulb during the development of newbornCremastrapseudobulb was measured by ELISA. The result shows that the content and ratio of new and old pseudobulb endogenous hormone exhibits changed regularly during the development of Cremastra newborn pseudobulb. The change of IAA content in new and old pseudobulb is more complex- changes of the pseudobulb rose after a sharp decline and then declined slightly in the first year; biennial pseudobulb changed in two peaks and three valley in the second year; triennial pseudobulb first increased and then decreased and again increased and decreased in the third year. The changes of CTK content sharply fell and then slight rose at last declined in pseudobulb in the first year; biennial and triennial pseudobulb showed a bimodal curve in the second and third year. The changes trends of GA3content is that it increased and then decreased and then again rose and decreased at last sharply increased in pseudobulb in the first year; biennial pseudobulb first increased and then decreased and then again rose in the second year; triennial pseudobulb first fell and then rose again fell and rose in the third year. The overall change of ABA content is that it increased first and then decreased. The ratio changes of IAA/CTK and IAA/ABA first declined and then changed in a bimodal curve.

Cremastraappendiculata(D. Don) Makino；pseudobulb；endogenous hormones；development

2016-03-17；

2016-04-05

國家自然科學基金“杜鵑蘭新生假鱗莖機制機理及其叢生芽誘導途徑研究”(81360613)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計劃(黔科合人才[2015]4031號)。

張明生(1963-)，男，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：植物生理生化與生物技術；E-mail: mszhang@guz.edu.cn。

S682.31

A

1008-0457(2016)02-0034-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.007