秦珂，孫靜（.山東省萊蕪市第一中學(xué)，山東萊蕪2700；2.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物教研室，山東萊蕪2700）

殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒的工藝優(yōu)化

秦珂1，孫靜2，*
（1.山東省萊蕪市第一中學(xué)，山東萊蕪271100；2.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物教研室，山東萊蕪271100）

采用殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)確定固定化果膠酶澄清低度姜酒的最優(yōu)工藝為：固定化酶濃度為60 g/L，pH值為3.5，酶解溫度和時(shí)間分別是45℃和12 h。在該工藝下低度姜酒透光率可達(dá)98.9%，所得低度姜酒穩(wěn)定性好，殼聚糖固定化果膠酶重復(fù)使用7次后姜酒透光率仍保留有81.2%。固定化果膠酶比游離酶澄清低度姜酒效果好，穩(wěn)定性提高。

殼聚糖；固定化酶；果膠酶；低度姜酒；澄清

果膠酶作為一種有效的澄清劑，利用果膠酶水解引起混濁的果膠物質(zhì)廣泛用于果汁、果酒的澄清［1-2］，研究人員之前已進(jìn)行了果膠酶澄清低度姜酒的研究［3］，但由于游離的果膠酶穩(wěn)定性較差，易失活，價(jià)格高，不易回收利用，而固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增加穩(wěn)定性、可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)物分開等顯著優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)［4-7］。本文以戊二醛為交聯(lián)劑，殼聚糖為載體制備固定化果膠酶，應(yīng)用于低度姜酒的澄清工藝中，確定最佳工藝參數(shù)，以期為低度姜酒的澄清工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

殼聚糖（食品級(jí)）：上海卡博工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；果膠酶（食品級(jí)，粉末狀）：鄭州眾信化工產(chǎn)品有限公司；TGL18臺(tái)式離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器：金壇市華偉儀器廠；UV-2102PC紫光可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA1004電子分析天平：上海市百典儀器廠；抽濾裝置等。

1.2方法

1.2.1工藝流程［3］

生姜→姜酒→酶解→過濾→灌裝→檢驗(yàn)→成品

1.2.2殼聚糖固定化果膠酶的制備

100 mL 1%冰醋酸中加殼聚糖1 g，攪拌均勻，滴入10%NaOH溶液至pH 7.0，加入5%戊二醛，攪拌靜置抽濾并用去離子水洗至中性后加入果膠酶液（果膠酶/殼聚糖=10 mg/1 g），緩慢振蕩混合30 min左右，4℃條件下固定12 h，用蒸餾水沖洗、抽干制得固定化果膠酶［8］。

1.3測(cè)定方法［3］

低度姜酒澄清度、色度的測(cè)定：采用分光光度計(jì)法，分別以透光率值T670、A420表示。

可溶性固形物：糖度計(jì)法。

總糖：直接滴定法，以葡萄糖計(jì)（GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》）。

總酸：滴定法。

總酚：Folin—Denis法。

穩(wěn)定性研究：通過將酒液冷凍到接近其冰點(diǎn)，觀察有無沉淀現(xiàn)象及瓶底沉淀物的多少。

1.4固定化果膠酶澄清低度姜酒的工藝參數(shù)確定

1.4.1單因素試驗(yàn)

研究固定化酶用量（濃度）、pH值、酶解時(shí)間、反應(yīng)溫度4個(gè)因素對(duì)固定化酶澄清低度姜酒的影響。

1.4.2正交試驗(yàn)

以透光率作為質(zhì)量指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以果膠酶濃度、pH值、酶解時(shí)間、溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)固定化果膠酶澄清條件。

1.5最優(yōu)條件澄清低度姜酒的效果評(píng)價(jià)

在最優(yōu)條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，對(duì)固定化果膠酶處理前后低度姜酒的透光率T670、吸光度A420、可溶性固形物、總酸、總酚、穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6殼聚糖固定化果膠酶的操作穩(wěn)定性

在最優(yōu)條件下，連續(xù)使用固定化果膠酶澄清低度姜酒10次，測(cè)定低度姜酒的澄清度，試驗(yàn)平行3次，每次使用后用去離子水清洗殼聚糖固定化酶，抽干。

2　結(jié)果與分析

2.1固定化果膠酶澄清低度姜酒單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1固定化果膠酶濃度的影響

分別在一定量的低度姜酒中加入30、40、50、60、70 g/L固定化果膠酶，調(diào)pH值為4，45℃下酶解12 h，取上清液測(cè)透光率。試驗(yàn)平行3次，結(jié)果顯示透光率隨固定化果膠酶濃度增加而升高，當(dāng)加酶量增加至60 g/L以上時(shí)，透光率的增幅較小。故選用50 g/L～70 g/L范圍用于正交試驗(yàn)。

2.1.2固定化果膠酶酶解溫度的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/L，調(diào)節(jié)pH值為4，溫度分別為30、40、45、50、55℃，酶解12 h，取上清液測(cè)透光率。試驗(yàn)平行3次，結(jié)果顯示隨溫度升高，低度姜酒透光率先增加后下降；45℃時(shí)，透光率達(dá)到最大，故選用40℃～50℃范圍用于正交試驗(yàn)。

2.1.3固定化果膠酶酶解時(shí)間的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/L，調(diào)節(jié)pH值為4，溫度45℃，分別酶解3、6、9、12、15 h，取上清液測(cè)透光率。試驗(yàn)平行3次，結(jié)果顯示，透光率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；12h時(shí)，透光率達(dá)到最大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到12 h以上時(shí)，透光率的增加較緩慢，說明酶解反應(yīng)已基本完成，故選用9 h～15 h范圍用于正交試驗(yàn)。

2.1.4固定化果膠酶酶解pH值的影響

在一定量的低度姜酒中加入固定化果膠酶60 g/ L，45℃酶解12 h，調(diào)pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，取上清液測(cè)透光率。試驗(yàn)平行3次，結(jié)果顯示低度姜酒透光率在pH值為3.5之前，呈急速上升趨勢(shì)，在pH值為3.5時(shí)達(dá)到最大值，超過3.5后，又呈下降趨勢(shì)。說明pH 3.5為固定化果膠酶的最適pH值，故選用pH值為3.0～4.0范圍用于正交試驗(yàn)。

2.2酶解的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)酶用量（A）、作用溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH值（D）進(jìn)行綜合研究，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以透光率作為質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1　固定化果膠酶澄清低度姜酒正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Results of orthogonal test L9（34）for clarifying low-ginger liquor of the immobilized pectinase

由表1極差分析可知，影響低度姜酒透光率的因素順序是作用溫度（B）＞pH值（D）＞固定化果膠酶用量（A）＞酶解時(shí)間（C）。固定化果膠酶澄清低度姜酒的最佳水平為：A2B2C2D2，即最佳酶解工藝條件為：酶量為60 g/L，溫度為45℃，pH值為3.5，酶解時(shí)間為12 h。

2.3最優(yōu)條件下固定化果膠酶澄清低度姜酒效果評(píng)價(jià)

為探討最優(yōu)條件澄清低度姜酒的效果，以固定化果膠酶用量為60 g/L，處理溫度為45℃，處理pH值為3.5，酶解時(shí)間為12 h進(jìn)行試驗(yàn)，以透光率、色度、可溶性固形物、總酸、總酚、穩(wěn)定性等為指標(biāo)，測(cè)定澄清前后低度姜酒各項(xiàng)指標(biāo)變化結(jié)果見表2。

由表2可知，固定化果膠酶處理低度姜酒后，透光率為98.9%，提高22.86%，吸光度、總酚含量、可溶性固形物、總糖、總酸含量分別降低79.65%、54.37%、16.95%、20.31%、16.89%，穩(wěn)定性增加。固定化果膠酶的澄清效果要比單獨(dú)使用游離酶要好［3］。這可能是因?yàn)闅ぞ厶鞘翘烊坏年?yáng)離子型絮凝劑，對(duì)蛋白質(zhì)、多酚、果膠等具有良好的吸附和絮凝作用，殼聚糖和果膠酶二者結(jié)合，有利于提高澄清效果、降低成本［9-10］。

表2　最優(yōu)澄清處理對(duì)低度姜酒相關(guān)指標(biāo)的影響Table 2　Effects of clarifying treatments on related indicators of low-ginger liquor

2.4殼聚糖固定化果膠酶的操作穩(wěn)定性

為了研究固定化酶的穩(wěn)定性，對(duì)固定化果膠酶連續(xù)進(jìn)行10批次澄清姜酒的操作，結(jié)果見表3。

表3　殼聚糖固定化果膠酶澄清低度姜酒的操作穩(wěn)定性Table 3　Stability of immobilized pectinase on clarification of low-ginger liquor

由表3可知，隨著固定化果膠酶澄清姜酒重復(fù)次數(shù)的增加，姜酒透光率逐漸下降，可能是因?yàn)闅ぞ厶枪潭ɑz酶本身失活以及回收過程中損失引起的［5-6］。連續(xù)使用7次后，姜酒透光率仍能達(dá)到81.2%，說明該固定化酶具有一定的操作穩(wěn)定性。相比單純使用游離果膠酶，殼聚糖固定化酶可反復(fù)或連續(xù)使用，降低成本，提高酶的穩(wěn)定性。

3　討論與結(jié)論

殼聚糖是氨基葡萄糖的直鏈多聚糖，對(duì)人體無毒、無害［8］，采用殼聚糖作為載體制得的固定化酶，機(jī)械強(qiáng)度大，穩(wěn)定性好，重復(fù)利用率高，降低了生產(chǎn)成本、提高了產(chǎn)品質(zhì)量［11］。

固定化果膠酶酶解低度姜酒，相對(duì)單獨(dú)使用游離酶，澄清效果好，研究表明，最佳工藝條件為：酶量為60 g/L，溫度為45℃，pH值為3.5，酶解時(shí)間為12 h。在此條件下所得姜酒透光率為98.9%，所得姜酒清徹透明，黃色至金黃色，久置無分層，無懸浮物，穩(wěn)定性好，提高了低度姜酒的質(zhì)量。

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Optimization the Technology of Low-ginger Liquor Clarification by the Pectinase Immobilized with Chitosan

QIN Ke1，SUN Jing2，*
（1.Laiwu No.1 Senior High School Shandong Province，Laiwu 271100，Shandong，China；2.Biochemistry Staff
Room，Laiwu Vocational Technology Institute，Laiwu 271100，Shandong，China）

Chitosan-immobilized pectinase was applied to clarify low-ginger liquor.Based on the result of single factor experiments，orthogonal experiment was performed.The optimizate conditions for charification of lowginger liquor were：immobilized enzyme amount 60 g/L，pH value 3.5，enzymolysis temperature 45℃，enzymolysis time 12 h，transmittance reached 98.9%，The transmittancy of low-ginger liquor was 81.2%after immobilized enzyme was repeatedly used seven times.The clarification effects of immobilized enzyme were better than free enzyme.

chitosan；immobilized enzyme；pectinase；low-ginger liquor；clarification

2015-09-19

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011GGA12054）；萊蕪高新區(qū)科技創(chuàng)新與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201015）

秦珂（1998—），女（漢），高中，研究方向：生物、化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

孫靜，女（漢），副教授，研究方向：生物化工及生物化學(xué)教學(xué)及研究。