蔡 明，楊得娟，胡飛翔，任國勝，何光龍.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 40006；.俄亥俄州立大學EPR核心實驗室，哥倫布 40000，美國

基于EPR監(jiān)測乳腺癌腫瘤微環(huán)境氧分壓水平作為化療敏感的指標研究

蔡 明1，楊得娟1，胡飛翔1，任國勝1，何光龍2
1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 400016；2.俄亥俄州立大學EPR核心實驗室，哥倫布 400020，美國

背景與目的：腫瘤微環(huán)境在介導腫瘤獲得性耐藥的外源性因素中發(fā)揮了重要作用。許多化療藥物的抗腫瘤效應依賴于腫瘤微環(huán)境氧分壓（oxygen pressure，pO2）水平狀況。該研究擬探討基于電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）技術監(jiān)測腫瘤富氧環(huán)境下增加化療敏感性的可行性。方法：采用MCF-7細胞建立人乳腺癌裸鼠移植瘤，通過EPR監(jiān)測化療時腫瘤組織pO2的水平。比較基于pO2峰值化療與常規(guī)化療不同模式下腫瘤體積的變化，通過流式細胞技術檢測腫瘤細胞凋亡。采用激光多普勒組織灌注檢測儀檢測腫瘤局部血流量（regional blood flow，RBF），分光光度計檢測腫瘤線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADH-DH）、琥珀酸細胞色素C還原酶（SCR）和細胞色素C氧化酶（CcO）活性。結果：基于pO2峰值化療及常規(guī)化療后較對照組腫瘤體積均顯著縮?。郏? 220.75±148.91） mm3、（1 788.42±172.30） mm3和（2 512.55±201.22） mm3，P＜0.01］，但基于pO2峰值化療組抑瘤率顯著高于常規(guī)化療組（51.43% vs 28.82%，P＜0.01）；移植瘤細胞凋亡率檢測進一步證實，基于pO2峰值化療較常規(guī)化療更利于殺傷腫瘤細胞（P＜0.001）。該研究初步研究了腫瘤微環(huán)境pO2變化的機制：這與化療后腫瘤組織線粒體耗氧與組織局部血流量之間的平衡改變有關。結論：基于EPR氧測定技術實現(xiàn)對腫瘤組織pO2的長期監(jiān)測，并以pO2峰水平作為化療時間窗提高化療敏感性，為臨床個體化化療提供新的策略和思路。

電子順磁共振；腫瘤微環(huán)境；氧分壓；乳腺癌

低氧是實體瘤微環(huán)境的基本特征之一［1］。腫瘤微環(huán)境低氧不僅使腫瘤自身更具有侵襲性易發(fā)生遠處轉移，而且使腫瘤對化療的抗拒性增加［2］。因此，有關低氧對實體腫瘤耐藥的研究近年來受到廣泛關注。監(jiān)測腫瘤微環(huán)境中氧分壓（oxygen pressure，pO2）變化的技術具有較好的臨床應用和基礎研究的前景［3］。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）氧測定技術為活體組織器官pO2的變化監(jiān)測提供了重要的技術支持，并已廣泛用于基礎或臨床研究中［4-5］。本課題組前期應用EPR技術對人乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤pO2進行初步監(jiān)測，證實腫瘤低氧的特性［6］。本研究首先通過建立人乳腺癌細胞株MCF-7裸鼠移植瘤模型，利用EPR技術研究化療后腫瘤組織pO2變化規(guī)律，建立依據(jù)腫瘤pO2微環(huán)境新化療模型，以期增加化療敏感性。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞株

乳腺癌MCF-7細胞株購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection，ATCC）。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）中，置于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)傳代。4周齡雌性裸鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0001］。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學倫理委員會許可。

1.1.2相關試劑及儀器

酶還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADPH-DH）、琥珀酸細胞色素C還原酶（SCR）和細胞色素C氧化酶（CcO）等檢測試劑及抗體購自美國Sigma公司，采用流式細胞術檢測，溫育緩沖液由pH為7.4，含10 mmol/L HEPES/NaOH、140 mmol/L NaCl和5 mmol/L CaCl2標記液制備。FITC-Annexin Ⅴ和PI購自德國寶靈曼公司，將其加入到溫育緩沖液中，終質(zhì)量濃度均為1 μg/ mL。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國PIERCE生物技術公司。電子順磁共振儀（GmbHL-Band 4型）購自德國Magnettech公司。激光多普勒血流探測儀（P10d型）購自英國Moor Instrument公司。

1.2方法

1.2.1人乳腺癌移植瘤動物模型建立及分組

培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞株，構建MCF-7細胞株BALB/c-nu/nu小鼠移植瘤動物模型，4周齡雌性裸鼠隨機分組實驗。將對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞配制成密度為1×107個/mL細胞懸液后接種于裸鼠上肢背側，每只小鼠注射0.1 mL，形成皮丘；2周后待腫瘤長徑大于等于3 mm時，植入LiPc氧敏感探針，并以正常乳腺組織為對照。建立多柔比星藥物處理組：在EPR監(jiān)測下第4周腫瘤pO2峰值出現(xiàn)時，予以腹腔注射多柔比星（75 mg/kg），并分別建立基于pO2峰值化療組即刻化療和常規(guī)3周定期化療組，同時設立腹腔注射0.9%NaCl溶液的對照組。本研究中對小鼠麻醉均使用氯胺酮（55 mg/kg）和甲芐噻嗪（15 mg/kg）聯(lián)合麻醉。

1.2.2EPR氧測定技術監(jiān)測活體MCF-7細胞移植瘤微環(huán)境pO2水平

將約10 μg為粉末狀或晶體狀氧敏感探針LiPc植入到腫瘤組織中，深度為0.5～1 mm，通過EPR檢測pO2變化信號。相關參數(shù)中波頻為1.1 GHz，微波功率為16 mW，調(diào)幅為0.045 GHz。探針LiPc可測量氧分壓水平范圍為0～150 mmHg，其靈敏度為5.9 mG/mmHg。

1.2.3流式細胞儀檢測各組腫瘤細胞凋亡

多柔比星化療前、第2次化療后和第4次化療后處死小鼠收集腫瘤組織，并采用機械分散法和酶輔助消化法進行處理。流式細胞儀激發(fā)光波長為488 nm，波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.2.4觀測裸鼠移植瘤的大小和一般情況

用游標卡尺測量瘤體長徑（a）、短徑（b）。按公式V= （1/2）ab2計算移植瘤的體積。藥物處理組的移植瘤生長抑制率（IR）=（1-實驗組移植瘤體積/陰性對照組移植瘤體積）′100%。

1.2.5激光多普勒血流探測儀檢測腫瘤局部血流量（regional blood flow，RBF）

2018年1月，比亞迪華為聯(lián)合打造的全球首條無人駕駛云軌正式開通。該“云軌”項目的無人駕駛系統(tǒng)已經(jīng)達到無人駕駛四個等級中的最高等級——全自動無人駕駛(UTO)，可實現(xiàn)全自動運行，并且還具有安全追蹤間隔最小、斷電無人駕駛、自動診斷、休眠喚醒、客流實時監(jiān)測、人臉識別等多項功能。

檢測腫瘤組織pO2出現(xiàn)峰值時腫瘤RBF變化。待小鼠麻醉后，剪開皮膚顯露腫瘤組織，將直徑約2 mm的吸盤粘附于腫瘤表面。吸盤的另一端通過光纖與激光多普勒血流探測儀相連接，監(jiān)測RBF。

1.2.6腫瘤組織線粒體NADH-DH、SCR和CcO活性檢測

切取腫瘤組織，0 ℃ PBS充分沖洗。使用含有β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷、乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸、蛋白激酶抑制劑等成分的HEPES緩沖液勻漿組織標本。NADHDH、SCR和CcO活性分別用NADH-DH、SCR和CcO活性緩沖液進行檢測。消光系數(shù)（ε）：細胞色素C的ε550 nm為18.5 mmol/（L·cm），NADH 的ε340 nm為6.22 mmol/（L·cm）。組織蛋白濃度用BCA法檢測并調(diào)整一致。

1.3統(tǒng)計學處理

采用Sigma Plot 12.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。所有實驗數(shù)據(jù)采用±s 表示。組織pO2采用多因素方差分析，線粒體酶活性和酶蛋白表達采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1人乳腺癌移植瘤生長過程中腫瘤微環(huán)境pO2變化

在小鼠MCF-7移植瘤成瘤直徑大于等于3 mm時植入LiPc探針，每周通過EPR監(jiān)測腫瘤組織pO2變化。移植細胞成瘤初始pO2值為（10.14±0.31） mmHg，隨著腫瘤增大腫瘤組織pO2逐步升高，至第4周時pO2形成峰值［（16.82±0.84） mmHg］，較正常小鼠乳腺組織中的pO2［（13.71±0.41） mmHg］顯著升高（P＜0.01），隨后組織pO2逐漸降低。

腫瘤自然生長成瘤，第4周出現(xiàn)pO2峰值（A0點）時，多柔比星藥物處理組的腫瘤組織pO2逐漸上升，至給藥后第4天形成峰值（A4），隨后pO2逐漸降低（圖1）。A4時刻腫瘤組織線粒體活性檢測發(fā)現(xiàn)，給藥前腫瘤組織線粒體酶NADH-DH、SCR、CcO活性均較化療前顯著降低（圖2A），此時刻腫瘤RBF測定顯示與給藥前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3A）。A4時刻行第2次化療，基于EPR監(jiān)測發(fā)現(xiàn)給藥后第1天再次出現(xiàn)pO2峰值（B1），此時刻腫瘤組織線粒體酶NADH-DH、SCR、CcO活性均較給藥前顯著降低（P＜0.01，圖2B），RBF與給藥前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3B）。B1時刻行第3次化療，化療開始后pO2迅速下降，于第3天pO2降至波谷后逐漸上升，并于第5天（C5）達到峰值。C5時刻腫瘤組織線粒體活性檢測發(fā)現(xiàn)，給藥前腫瘤組織線粒體酶NADH-DH、SCR、CcO活性均較化療前顯著下降（P＜0.05，圖2C），RBF較給藥前也顯著降低（P＜0.05，圖3C）。C5時刻行第4次化療，給藥后第1天pO2迅速下降并一直維持在低水平，腫瘤組織線粒體酶NADH-DH、SCR、CcO活性與化療前無明顯變化（P＞0.05，圖2D），RBF較化療前明顯降低（P＜0.01，圖3D）。

圖1　不同化療周期中腫瘤組織pO2變化Fig.1　Monitoring of changes in pO2levels in tumor microenvironments at various medication times

圖2　化療各周期腫瘤組織pO2峰值時NADH-DH、SCR和CcO活性變化Fig.2　Changes in mitochondrial enzyme activity based on NADH-DH，SCR，and CcO at pO2peak time in tumor tissues in each cycle ofchemotherapy

2.3流式細胞術檢測各組腫瘤細胞凋亡率

流式細胞術檢測化療前（T0）、第2次化療后（T2）以及第4次化療后（T4）基于腫瘤組織pO2化療組和常規(guī)化療組的腫瘤細胞凋亡率的結果提示，建立基于pO2峰值化療組在第2次化療（32.6% vs 19.6%）以及第4次化療（60.6% vs 27.2%）時凋亡率較常規(guī)化療組顯著增加（P＜0.001，圖4）。

2.4裸鼠移植瘤生長的情況

化療結束后處死裸鼠，測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積及抑瘤率。結果顯示，基于pO2峰值化療前化療組的腫瘤體積（437.9±121.20） mm3，與0.9% NaCl溶液對照組的腫瘤體積（451.30±107.82） mm3比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），常規(guī)化療組的腫瘤體積（445.10±110.40） mm3與0.9%NaCl溶液對照組（451.30±107.82） mm3比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?；趐O2峰值化療后化療組的腫瘤體積（1 220.75±148.91） mm3，與0.9%NaCl溶液對照組（2 512.55±201.22） mm3相比明顯縮?。≒＜0.001），常規(guī)化療組的腫瘤體積（1 788.42±172.30） mm3，與0.9%NaCl溶液對照組（2 512.55±201.22） mm3相比明顯縮?。≒＜0.001）?；趐O2峰值化療組腫瘤抑制率（51.43%）顯著高于常規(guī)化療組（28.82%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3　化療各周期不同時刻腫瘤RBF監(jiān)測Fig.3　RBF measurements at diferent time points in each cycle of chemotherapy

圖4　流式細胞術檢測基于pO2峰值化療組和常規(guī)化療組腫瘤細胞凋亡率Fig.4　Comparison of the apoptotic rates of transplanted tumor cells between pO2peak-based chemotherapy and conventional chemotherapy groups by fow cytometry

3　討　論

研究表明，低氧是實體瘤對放療或化療產(chǎn)生耐受的重要原因之一，是反映腫瘤患者預后的獨立指標［7-9］。許多化療藥物的抗腫瘤效應依賴于腫瘤微環(huán)境pO2水平狀況［10-11］。多柔比星的細胞毒作用受腫瘤微環(huán)境pO2的影響，在有氧環(huán)境下多柔比星半醌自由基與氧分子的作用產(chǎn)生超氧化合物，這些超氧化合物自由基可通過歧化反應形成過氧化氫并分解為氫自由基，共同對細胞膜產(chǎn)生級聯(lián)氧化應激損傷和DNA裂解作用［12］。

本研究利用EPR對腫瘤生長中pO2精細監(jiān)測，當腫瘤自然生長出現(xiàn)氧峰值時首次給藥治療，并監(jiān)測給藥后腫瘤的pO2變化；給藥后第4天峰值出現(xiàn)時再次化療，并發(fā)現(xiàn)第2次給藥后第1天，第3次給藥后第5天均出現(xiàn)峰現(xiàn)象，但在第4次化療后腫瘤組織pO2迅速下降，未出現(xiàn)峰現(xiàn)象。本研究通過供氧和耗氧的關系分別對不同峰時刻的腫瘤RBF和線粒體活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)第1次和第2次化療后腫瘤組織線粒體活性顯著降低，腫瘤細胞受損，但腫瘤RBF無明顯變化，提示化療早期對腫瘤血管影響并不明顯。第3次化療后可能由于腫瘤血管進一步受損致使供氧不足導致pO2迅速下降，但隨后腫瘤組織pO2再次上升出現(xiàn)峰現(xiàn)象，與峰谷期相比峰值時刻腫瘤RBF顯著增加，提示腫瘤中血管可能再生；線粒體活性的進一步降低提示腫瘤細胞可能受損、被殺傷。第4次化療后通過對線粒體活性分析發(fā)現(xiàn)，化療前與化療后并無明顯差異。本研究觀察到，新化療模式對乳腺癌移植瘤的生長抑制有確切的效果：基于pO2峰值化療對腫瘤的生長體積具有明顯的抑制作用，其腫瘤抑制率（51.43%）顯著高于常規(guī)化療組（28.82%），差異有統(tǒng)計學意義。腫瘤細胞凋亡率分析提示，基于pO2峰值的化療模式較常規(guī)化療模式增強了化療對腫瘤的殺傷作用。通過上述數(shù)據(jù)推測，基于pO2峰值化療可顯著提高化療敏感性，更有效地阻止腫瘤的生長、增殖，延緩腫瘤發(fā)展。

初步分析pO2可能變化的原因：① 實體瘤在一定體積上再繼續(xù)生長就需要血管提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤細胞生長速度超過內(nèi)皮細胞，因此局部血供不能滿足腫瘤生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)生缺血缺氧以致壞死。② 腫瘤血管密度在腫瘤形成早期往往逐漸上升，但后期趨于下降，相鄰毛細血管間距離增大，隨之出現(xiàn)腫瘤缺氧和中心壞死。④ 在單位體積腫瘤中，新生血管的生長速度常隨腫瘤生長而下降，但管徑增加，表面積逐漸下降，降低了腫瘤生長需要的代謝交換率［13］。

EPR為活體組織生理及病理pO2的變化監(jiān)測提供了重要的技術支持。多柔比星細胞毒作用依賴于腫瘤富氧環(huán)境，本研究利用EPR準確發(fā)現(xiàn)pO2峰值出現(xiàn)時刻，可評價腫瘤微環(huán)境pO2峰值為治療時間窗的可行性及有效性，為臨床個體化化療提供新的策略和思路。

［1］ OKUNIEFF P，O'DELL W，ZHANG M，et al.Tumor oxygen measurements and personalized medicine［J］.Adv Exp Med Biol，2013，765: 195-201.doi: 10.1007/978-1-4614-4989-8_27.

［2］ TEICHER B A.Hypoxia and drug resistance［J］.Cancer Metastasis Rev，1994，13（2）: 139-168.

［3］ GAERTNER F C，SOUVATZOGLOU M，BRIX G，et al.Imaging of hypoxia using PET and MRI［J］.Curr Pharm Biotechnol，2012，13（4）: 552-570.

［4］ MAJEWSKI W，KRZYMINIEWSKI R，STANISI? M，et al.Measurement of free radicals using electron paramagnetic resonance spectroscopy during open aorto-iliac arterial reconstruction［J］.Med Sci Monit，2014，20: 2453-2460.doi: 10.12659/MSM.890774.

［5］ WILLIAMS B B，DONG R，NICOLALDE R J，et al.Physically-based biodosimetry using in vivo EPR of teeth in patients undergoing total body irradiation［J］.Int J Radiat Biol，2011，87（8）: 766-775.

［6］ 蔡 明，李袁靜，劉勝春，等.乳腺腫瘤組織氧分壓及線粒體功能的實驗研究［J］.中國腫瘤臨床，2011，38（18）: 1131-1134.

［7］ DOUBLIER S，BELISARIO D C，POLIMENI M，et al.HIF-1 activation induces doxorubicin resistance in MCF-7 3-D spheroids via P-glycoprotein expression: a potential model of the chemo-resistance of invasive micropapillary carcinoma of the breast［J］.BMC Cancer，2012，12: 4.doi: 10.1186/1471-2407-12-4.

［8］ PITSON G，F(xiàn)YLES A，MILOSEVIC M，et al.Tumor size and oxygenation are independent predictors of nodal diseases in patients with cervix cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，51（3）: 699-703.

［9］ WIJSMAN R，KAANDERS J H，OYEN W J，et al.Hypoxia and tumor metabolism in radiation oncology: targets visualized by positron emission tomography［J］.Q J Nucl Med Mol Imaging，2013，57（3）: 244-256.

［10］ ERLER J T，CAWTHORNE C J，WILLIAMS K J，et al.Hypoxia-mediated down- regulation of Bid and Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor 1-dependent andindependent mechanisms and contributes to drug resistance ［J］.Mol Cell Biol，2004，24（7）: 2875-2889.

［11］ BAKER J H，KYLE A H，BARTELS K L，et al.Targeting the tumour vasculature: exploitation of low oxygenation and sensitivity to NOS inhibition by treatment with a hypoxic cytotoxin［J］.PLoS One，2013，8（10）: e76832.

［12］ VUJASKOVIC Z，ROSEN E L，BLACKWELL K L，et al.Ultrasound guided pO2measurement of breast cancer reoxygenation after neoadjuvant chemotherapy and hyperthermia treatment［J］.Int J Hyperthermia，2003，19（5）: 498-506.

［13］ RAK J，YU J L.Oncogenes and tumor angiogenesis: the question of vascular “supply” and vascular “demand”［J］.Semin Cancer Biol，2004，14（2）: 93-104.

Scheduling of chemotherapy based on direct monitoring of pO2in tumor microenvironment by EPR oximetry

CAI Ming1，YANG Dejuan1，HU Feixiang1，REN Guosheng1，HE Guanglong2（1.Department of Endocrine and Breast Surgery，the First Afliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China； 2.The EPR Core Lab，the Ohio State University，Columbus 400020，USA）

Correspondence to: CAI MingE-mail: cai.ming@rocketmail.com

Background and purpose： Tumor microenvironment plays an important role in the introduction of foreign factors that mediate tumor acquired resistance.The antitumor effects of many chemotherapeutic agents depend on the level of oxygen pressure （pO2） in tumor microenvironment.This study aimed to evaluate electron paramagnetic resonance （EPR）-based monitoring on an oxygen-enriched tumor microenvironment to increase chemotherapeutic sensitivity.Methods： MCF-7 cells were used to establish human breast cancer in nude mice.EPR was used to directly measure pO2level in vivo.Tumor tissues were collected，and mitochondrial activity was assayed on the basis of the kinetics of enzyme-catalyzed reactions.A laser Doppler monitor was used to detect regional blood flow.Tumor apoptotic rate was analyzed by flow cytometry.Results： The tumor volume decreased more evidently in the chemotherapy group with oxygen-enriched environment than that in the conventional chemotherapy group after the treatment was administered （P＜0.01）.After chemotherapy was completed，the apoptotic rate of tumor cells was significantly higher in the chemotherapy group with oxygen-enriched environment than that in the conventional chemotherapy group （P＜0.001）.This study examined the mechanism of pO2changes in tumor microenvironment: This was related to the change of the balance between the oxygen consumption and the regional blood flow in the tumor tissues after chemotherapy.Conclusion： Based on the characteristics of pO2changes in the tumor microenvironment after chemotherapy was completed，the selection of chemotherapy mode forthe treatment in pO2peak time window improves the sensitivity of chemotherapy，which provides a new idea for individualized chemotherapy in clinical applications.

Electron paramagnetic resonance； Tumor microenvironment； pO2； Breast cancer

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.07.005

R737.9

A

1007-3639（2016）07-0589-07

蔡 明 E-mail:cai.ming@rocketmail.com

2015-04-08

2016-01-10）